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バキュロウイルスが感染しません トピック削除
No.7769-TOPIC - 2019/03/15 (金) 01:35:35 - だいちょうきん
平素は大変お世話になっております。

バキュロウイルス発現系を利用して、興味ある組換えタンパク質を分泌タンパク質としてSf21昆虫細胞で発現させようとしています。

6ウェルディッシュに播種したSf21にバクミドをトランスフェクションし、その48時間後の培養上清(濃縮せず、これを10 ulを1ウェルにアプライしました)を電気泳動したところ、驚いたことに5 ugのものがCBB染色で検出されました。つまり、P1ウイルス液の時点で5 ug/10 ul=0.5 mg/mlとなりました。

これで十分実験に使える分が確保されたのですが、一応ウイルスの増幅を行いたく、このP1ウイルス液を未感染Sf21に感染させました。x1、x3、x9、x12と希釈しましたが、どの細胞も”感染していない”ようでした。
その根拠は1. 細胞が死なない。2. タンパク質を作っていない。

です。
つまり、Sf21にバクミドをトランスフェクションすると確かに欲しい物は大量に作ってはくれましたが、感染可能なバキュロウイルスは作出されていないように思えます。

”ウイルスタイターが上がらない”もしくは”ウイルスができない”というトラブルでトラブルシュートを探しても該当する項目が見つかりませんでした。

P1で確かにこと済ませてますが、ウイルスが出来ていない理由がわかりません。
できれば納得して先に進みたいので、ご意見ありましたら宜しくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.7769-5 - 2019/03/15 (金) 11:37:12 - だいちょうきん
Trackerさん

引き続き書き込みをありがとうございます。

> untransfectedの細胞培養上清がネガコンとのことなので、トランスフェクションという操作に細胞がレスポンスしていることも考慮して、空ベクターなどをトランスフェクションしたものをネガコンに用いてもいいかもしれません。

確かにそれはおっしゃる通りですね。はい、次回はコントロールベクターをトランスフェクションしてみます。

そしてそのバンドが目的のものかどうか、まずはウエスタンを行ってみます。

> 私がSf21細胞で膜タンパク質をやった時には10%血清を入れて、Bacmidの場合には72時間、ウイルスゲノム+トランスファーベクターのシステムでやる場合には96時間ほど感染させてP1ストックを作成していました。普段血清有りで培養しているなら、順化させずにいきなり血清を抜くと感染具合や目的タンパク質の発現は明らかに落ちる印象です。P1ストックだと大抵力価が弱々しかったので、新たにさらに72-96時間感染させたP2ストックを主に使用していました。

はい、普段から無血清培地で培養しています。
感染具合というのもやはりあるのですね。私の場合、ウイルス回収が48時間前と早いのに加え、細胞の状態も感染しやすい状況ではなかったのかもしれません。

私の組み替えタンパク質は人IgG Fc融合タンパク質なのもあり、精製にprotein Aを使うため、できれば血清は使用したくない理由があります。

Trackerさんとお話させていただいて、私もそのバンドが疑わしくなってきました。
すぐにウエスタンを行うことにします。

> とりあえずsuggestionとしては、P1やP2ウイルスストックを作るときだけでも血清を入れておくとかはどうですか。培養上清をできるだけキレイに保ちたいとは思うので、10〜100倍希釈しても充分なMOIで感染してくれる力価のウイルスが取れればそれで良いのではないかと思います。というか0.5mg/mlで発現するのが真であれば多少夾雑物があっても充分な純度まで精製するのは容易かと思います。

まずは手元にあるものでそれが真かどうかを確認し、精製してみることにします。
これが真なら6-well plateの6-wells全てにバクミドをトランスフェクションすれば、その上清12 mlから1 mg以上が精製出来る計算になります。信じられないですね・・・違うのかな・・・

ありがとうございます。またアップデートさせていただきます。

(無題) 削除/引用
No.7769-4 - 2019/03/15 (金) 10:34:27 - Tracker
なるほど、無血清なんですね。


untransfectedの細胞培養上清がネガコンとのことなので、トランスフェクションという操作に細胞がレスポンスしていることも考慮して、空ベクターなどをトランスフェクションしたものをネガコンに用いてもいいかもしれません。
P1ストックを作る際の培養上清で、しかも6wellスケール、48時間でsub mgオーダーの目的タンパク質ができるというのもなかなか衝撃的だったので、、。
目的タンパク質だといいですね。

私がSf21細胞で膜タンパク質をやった時には10%血清を入れて、Bacmidの場合には72時間、ウイルスゲノム+トランスファーベクターのシステムでやる場合には96時間ほど感染させてP1ストックを作成していました。
普段血清有りで培養しているなら、順化させずにいきなり血清を抜くと感染具合や目的タンパク質の発現は明らかに落ちる印象です。
P1ストックだと大抵力価が弱々しかったので、新たにさらに72-96時間感染させたP2ストックを主に使用していました。

とりあえずsuggestionとしては、P1やP2ウイルスストックを作るときだけでも血清を入れておくとかはどうですか。
培養上清をできるだけキレイに保ちたいとは思うので、10〜100倍希釈しても充分なMOIで感染してくれる力価のウイルスが取れればそれで良いのではないかと思います。
というか0.5mg/mlで発現するのが真であれば多少夾雑物があっても充分な純度まで精製するのは容易かと思います。

(無題) 削除/引用
No.7769-3 - 2019/03/15 (金) 01:49:35 - だいちょうきん
Trackerさん

早速ありがとうございます。本当に嬉しいです。

Sf21の培養液は血清フリーのものを使用しています。
バクミドトランスフェクション前をコントロールにし、トランスフェクションしてから24、48時間後に培養上清を取りCBB染色しました。

トランスフェクション前はかすかに何かが染まっていますが(培地由来の何かか、死細胞由来の何か)、導入後48時間でかなり濃いバンドが予想される位置に検出されました。なので、これがものだと考えています。

明日ウエスタンを行う予定です。

>またバキュロウイルスの増幅は何時間で行なっていますか?

はい、ここが改善の余地があるかもしれません。
バクミドトランスフェクション後、48時間目を持ってP1としました。
ただ、トラッカーさんが危惧されておられるように、組換えタンパク質の産生にウイルス産生が遅れる可能性がありますね。。

だいたいどれくらいでウイルス液を回収すべきでしょうか?

私はバクミド導入後、48時間でP1ウイルス液をとりましたが、その際に細胞をgp64抗体でフローサイトメトリーしましたら、30%のSf21で染まりましたので、バキュロウイルスは48時間でも出来ているものと考えていました。

(無題) 削除/引用
No.7769-2 - 2019/03/15 (金) 01:40:01 - Tracker
培養上清にはたくさんタンパク質が含まれるのでCBBだと判別は難しいと思いますが、どのように判別していますか?
またバキュロウイルスの増幅は何時間で行なっていますか?

バキュロウイルスが感染しません 削除/引用
No.7769-1 - 2019/03/15 (金) 01:35:35 - だいちょうきん
平素は大変お世話になっております。

バキュロウイルス発現系を利用して、興味ある組換えタンパク質を分泌タンパク質としてSf21昆虫細胞で発現させようとしています。

6ウェルディッシュに播種したSf21にバクミドをトランスフェクションし、その48時間後の培養上清(濃縮せず、これを10 ulを1ウェルにアプライしました)を電気泳動したところ、驚いたことに5 ugのものがCBB染色で検出されました。つまり、P1ウイルス液の時点で5 ug/10 ul=0.5 mg/mlとなりました。

これで十分実験に使える分が確保されたのですが、一応ウイルスの増幅を行いたく、このP1ウイルス液を未感染Sf21に感染させました。x1、x3、x9、x12と希釈しましたが、どの細胞も”感染していない”ようでした。
その根拠は1. 細胞が死なない。2. タンパク質を作っていない。

です。
つまり、Sf21にバクミドをトランスフェクションすると確かに欲しい物は大量に作ってはくれましたが、感染可能なバキュロウイルスは作出されていないように思えます。

”ウイルスタイターが上がらない”もしくは”ウイルスができない”というトラブルでトラブルシュートを探しても該当する項目が見つかりませんでした。

P1で確かにこと済ませてますが、ウイルスが出来ていない理由がわかりません。
できれば納得して先に進みたいので、ご意見ありましたら宜しくお願いいたします。

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