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(無題) 削除/引用 No.7769-17 - 2019/03/24 (日) 02:21:31 - だいちょうきん moz様ありがとうございます。 バクミドのPCRは試してはいませんが、ダイレクトシークエンスではM13プライマーでは読めませんでした。 今、Sf9の準備中です。 これで本当に上手く行くといいのですが... 一つまたお聞きしてもよろしいでしょうか？ 昆虫細胞の培養液はpH6ほどです。 精製したいタンパク質はFc融合ですので、pHを中性付近に合わせた方がプロテインAビーズへの結合がよくなると思いますが、2MのTris（pH8.8）を昆虫細胞の培地に対して100分の1量（終濃度20mMトリス）になるように加えると、培地が白濁し、遠心するとペレットが出来ます。この現象はフレッシュな培地でもこうなるので分泌した欲しいタンパク質が凝集しているわけではないということ、また血清も加えていないのでそれが凝集しているわけではないと思います。 moz様は、この昆虫細胞培地からどのように組換えタンパク質を精製されましたか？ 今考えているのが、 1. Trisで中性に調製後、遠心してペレットにモノが含まれていなかったら、クリアな上清をプロテインAビーズにかける 2. 透析によりバッファーをPBSに置換する 3. 昆虫細胞にPBSを加え滴定し、pHが中性付近になればそれをプロテインAビーズにかける 実は上記の凝集はTrisを加えた場合（終濃度20mMトリス）に必ず起こり、一方PBSで中性付近になるよう希釈して行く際には凝集は認められないことに気づきまして上記3を考えています。このプレリミはフレッシュな培地を用いて行いました。 一応バックアップとして、Fc融合タンパク質が精製できそうになければ、同じタンパク質でタグだけを変えた（His6 tag + StrepTagII tag）ものも用意していますが、ヒスチジンの等電点からやはりこの場合にも培地を中性かアルカリ性に持って行った方がいいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.7769-16 - 2019/03/23 (土) 20:57:14 - moz > mozさまは、バクミドのシークエンシングができないことは引っかかりますでしょうか？ どうしてもBacmidが出来ず、通常の方法でバキュロウイルスを作製したcDNAの経験はあります。原因は分かりません。単に下手だったのかもしれません。 > 普通はバクミドは読めるものでしょうか？ BACを抽出すれば読めると思いますが、RCAで増幅すればそのまま読めるかも？でもPCRで増えないのですよね。。欠失しているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7769-15 - 2019/03/23 (土) 00:16:16 - だいちょうきん Tracker様、 引き続き書き込みをいただき、本当に心強いです。ありがとうございます。 Sf9はウイルスを産生させて、High fiveでタンパク質産生という流れが推奨されている理由に漸く腑に落ちました。 さっそく、Sf9000 III SFMをオーダーしました。 早速Sf9で試してみます。 この度は本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7769-14 - 2019/03/23 (土) 00:13:47 - だいちょうきん おお様、 ありがとうございます。 書き方が混乱を招いてしまいましたが、pFastBac1プラスミドに目的の遺伝子をクローニング（DH5アルファを使用）した際はもちろんシークエンスにより配列は確かめています。 この構築されたプラスミドをDH10Bacに形質転換しなおして、その大腸菌ないで組替えを起こさせ、組換えバクミドを白コロニーとして得る流れです。 私の理解では、High-Fiveでも感染コンピテントなウイルスは作れるとは思いますが、Tracker様からの直近の書き込みではウイルス産生量も低いようです。 そうですね、かならずしもgp64のフローサイトの結果が遺伝子導入効率を示しているわけではないですよね。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7769-13 - 2019/03/22 (金) 23:22:13 - Tracker 貼り忘れました。失礼しました。 下記、参考までに。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3955137/#!po=1.08696

(無題) 削除/引用 No.7769-12 - 2019/03/22 (金) 23:20:05 - Tracker Sf21ではなくてHigh fiveでしたか。 確かにTF効率もあるかと思いますが、同じウイルス量を感染させても、細胞によってウイルスを上手に作るやつもいれば、下手くそなやつもいるので、できてくるウイルス量は変わります。バキュロウイルスに限りませんが。 例えば下記論文では、同じMOI(= multiplicity of infection,感染多重度)で比較すると、Sf9はHigh fiveなどの他の昆虫細胞と比較して1〜2log10のオーダーで多くバキュロウイルスを産生できるようです。 やはりバキュロウイルスの産生には、ウイルス産生という性状で十分にestablishされたcell lineであるSf9やSf21を使用されるのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.7769-11 - 2019/03/22 (金) 21:37:23 - おお 経験がないので想像で書きますが、感染できるウイルスができるのなら、トランスフェクションされた細胞からのウイルスが導入されてない細胞に感染できるはずなので、そう考えると３０％は実際のTF効率ではなくもっともっと低いのではないかと。 （調べてないけど２次感染した細胞はおそらく完全なウイルスを作らないかもしれないのでそういうのが見れない検出系になってれば別ですが）。

(無題) 削除/引用 No.7769-10 - 2019/03/22 (金) 21:28:44 - おお Constructionの時点で一度目的のプラスミドを（DH5alphaなどで）作って確認してから DH10Bacなどに入れるのだと思うのですが、Constructionの時点でインサートを確認してないのですか？

(無題) 削除/引用 No.7769-9 - 2019/03/22 (金) 11:11:38 - だいちょうきん mozさま、 早速書き込みいただきありがとうございます...。 その通りだと思います。サーモのカタログにはこう記載されています。 ”High FiveTM and MimicTM Sf9 cells are not recommended because they generally transfect less efficiently. However, after you have generated your baculovirus stock, you can use High Five” あくまでトランスフェクション効率が悪いためHigh-Fiveは推奨されないとのことでした。 ただ、私が条件検討しまして、遺伝子導入試薬で3割ほどHigh-Fiveに導入できていますので、そのまま行なっているところです。 mozさまは、バクミドのシークエンシングができないことは引っかかりますでしょうか？ 私のバクミドサンプルをバクミドバックボーンのプライマー（M13プライマー）と目的の遺伝子内でのプライマーでそれぞれ配列を読もうとしたところ、M13プライマーでは何も波形が出ず、また、目的の遺伝子内のプライマーで読むと綺麗に読め、目的の遺伝子の3’がpFastBac1にクローニングされていました。当たり前ですが。 これはつまり、私がバクミドだというサンプルのほとんどはプラスミドなのかもしれません...。 普通はバクミドは読めるものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7769-8 - 2019/03/22 (金) 10:58:19 - moz 最近バキュロウィルスは扱っていないので間違えているかもしれませんが、 SF9(Sf21）でウィルスを増やしてから、タンパク回収用にHigh-Fiveに感染させるのでは？？

(無題) 削除/引用 No.7769-7 - 2019/03/22 (金) 09:56:43 - だいちょうきん 一つ訂正です。 扱っている細胞はSf21ではなく、High-Fiveです。 すみません。

(無題) 削除/引用 No.7769-6 - 2019/03/22 (金) 05:31:38 - だいちょうきん トピ主です。 まだトラブルは解決しておりません。アップデートさせてください。 問題：感染可能なバキュロウイルスが出来ていないようです... 背景：私は前のラボでSf9昆虫細胞を使って分泌タンパク質を発現精製した経験があります。使用していたプラスミドはpFastBac1で、バクミド調製はDH10Bac大腸菌を使用していました。 今回別のラボでタンパク質を調製する必要があり、Sf21という分泌タンパク質に得意な昆虫細胞で分泌タンパク質を発現させようとしています。 方法は、pFastBac1にある遺伝子とヒトIgGのFc部位を融合させたものをクローニングし、塩基配列を確認後、DH10Bacに3つの抗生剤とIPTG/X-Galを加えて青白コロニー選択。約3日十分に青白選択プレートをインキュベートし、確実に白いコロニーをピックし、ミニカルチャー、バクミドを調製しました。 このバクミドをSf21にTranIt-Insectを用いてトランスフェクション。約5日後の培養上清をP1ウイルス液として、そのいくらかを新しいSf21に感染、ウイルスタイターの増幅、というプロセスを経ています。 ウイルスが出来ているかどうかは、バクミドをトランスフェクト後、細胞をBiolegendから購入した PE標識のanti-Baculovirus envelope gp64 Antibody で染める事で確認しています。 少なくともSf21の膜表面にはウイルスエンベロープgp64は3割ほどに確認されています。 問題1：P1ウイルス液を新しいSf21に感染させ、48時間後のSf21を調べるとgp64を発現する細胞がいない。 問題2：そもそも私の期待しているタンパク質がP1ウイルス液の中にも、P2ウイルス液の中にも含まれていませんでした。細胞のライセートにも見られずです。 考察：以上のことから感染可能なバキュロウイルスがP1ウイルス液には含まれていないということを含め、いろんな可能性が考えられます。 きちんとバクミドが出来ているかを確認するためM13プライマーでバクミドに目的の遺伝子がトランスポジションしているか確認しようとしたところ、M13プライマーで読める配列がありませんでした。2度行いました。バクミドが作られていない？けれどgp64は陽性になっていたし...と頭が混乱してきてしまいました。 懸念事項としてはDH10Bacは他のラボが自作したコンピを、私自身が私が所属するラボで自作し直した経緯があります。買うと五百ドルします...。この大腸菌がおかしいのでしょうか。 長く書いてしまい誠に恐縮なのですが、コメントをお寄せいただけると嬉しいです。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.7769-5 - 2019/03/15 (金) 11:37:12 - だいちょうきん Trackerさん 引き続き書き込みをありがとうございます。 > untransfectedの細胞培養上清がネガコンとのことなので、トランスフェクションという操作に細胞がレスポンスしていることも考慮して、空ベクターなどをトランスフェクションしたものをネガコンに用いてもいいかもしれません。 確かにそれはおっしゃる通りですね。はい、次回はコントロールベクターをトランスフェクションしてみます。 そしてそのバンドが目的のものかどうか、まずはウエスタンを行ってみます。 > 私がSf21細胞で膜タンパク質をやった時には10%血清を入れて、Bacmidの場合には72時間、ウイルスゲノム+トランスファーベクターのシステムでやる場合には96時間ほど感染させてP1ストックを作成していました。普段血清有りで培養しているなら、順化させずにいきなり血清を抜くと感染具合や目的タンパク質の発現は明らかに落ちる印象です。P1ストックだと大抵力価が弱々しかったので、新たにさらに72-96時間感染させたP2ストックを主に使用していました。 はい、普段から無血清培地で培養しています。 感染具合というのもやはりあるのですね。私の場合、ウイルス回収が48時間前と早いのに加え、細胞の状態も感染しやすい状況ではなかったのかもしれません。 私の組み替えタンパク質は人IgG Fc融合タンパク質なのもあり、精製にprotein Aを使うため、できれば血清は使用したくない理由があります。 Trackerさんとお話させていただいて、私もそのバンドが疑わしくなってきました。 すぐにウエスタンを行うことにします。 > とりあえずsuggestionとしては、P1やP2ウイルスストックを作るときだけでも血清を入れておくとかはどうですか。培養上清をできるだけキレイに保ちたいとは思うので、10〜100倍希釈しても充分なMOIで感染してくれる力価のウイルスが取れればそれで良いのではないかと思います。というか0.5mg/mlで発現するのが真であれば多少夾雑物があっても充分な純度まで精製するのは容易かと思います。 まずは手元にあるものでそれが真かどうかを確認し、精製してみることにします。 これが真なら6-well plateの6-wells全てにバクミドをトランスフェクションすれば、その上清12 mlから1 mg以上が精製出来る計算になります。信じられないですね・・・違うのかな・・・ ありがとうございます。またアップデートさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.7769-4 - 2019/03/15 (金) 10:34:27 - Tracker なるほど、無血清なんですね。 untransfectedの細胞培養上清がネガコンとのことなので、トランスフェクションという操作に細胞がレスポンスしていることも考慮して、空ベクターなどをトランスフェクションしたものをネガコンに用いてもいいかもしれません。 P1ストックを作る際の培養上清で、しかも6wellスケール、48時間でsub mgオーダーの目的タンパク質ができるというのもなかなか衝撃的だったので、、。 目的タンパク質だといいですね。 私がSf21細胞で膜タンパク質をやった時には10%血清を入れて、Bacmidの場合には72時間、ウイルスゲノム+トランスファーベクターのシステムでやる場合には96時間ほど感染させてP1ストックを作成していました。 普段血清有りで培養しているなら、順化させずにいきなり血清を抜くと感染具合や目的タンパク質の発現は明らかに落ちる印象です。 P1ストックだと大抵力価が弱々しかったので、新たにさらに72-96時間感染させたP2ストックを主に使用していました。 とりあえずsuggestionとしては、P1やP2ウイルスストックを作るときだけでも血清を入れておくとかはどうですか。 培養上清をできるだけキレイに保ちたいとは思うので、10〜100倍希釈しても充分なMOIで感染してくれる力価のウイルスが取れればそれで良いのではないかと思います。 というか0.5mg/mlで発現するのが真であれば多少夾雑物があっても充分な純度まで精製するのは容易かと思います。

(無題) 削除/引用 No.7769-3 - 2019/03/15 (金) 01:49:35 - だいちょうきん Trackerさん 早速ありがとうございます。本当に嬉しいです。 Sf21の培養液は血清フリーのものを使用しています。 バクミドトランスフェクション前をコントロールにし、トランスフェクションしてから24、48時間後に培養上清を取りCBB染色しました。 トランスフェクション前はかすかに何かが染まっていますが（培地由来の何かか、死細胞由来の何か）、導入後48時間でかなり濃いバンドが予想される位置に検出されました。なので、これがものだと考えています。 明日ウエスタンを行う予定です。 ＞またバキュロウイルスの増幅は何時間で行なっていますか？ はい、ここが改善の余地があるかもしれません。 バクミドトランスフェクション後、48時間目を持ってP1としました。 ただ、トラッカーさんが危惧されておられるように、組換えタンパク質の産生にウイルス産生が遅れる可能性がありますね。。 だいたいどれくらいでウイルス液を回収すべきでしょうか？ 私はバクミド導入後、48時間でP1ウイルス液をとりましたが、その際に細胞をgp64抗体でフローサイトメトリーしましたら、30％のSf21で染まりましたので、バキュロウイルスは48時間でも出来ているものと考えていました。

(無題) 削除/引用 No.7769-2 - 2019/03/15 (金) 01:40:01 - Tracker 培養上清にはたくさんタンパク質が含まれるのでCBBだと判別は難しいと思いますが、どのように判別していますか？ またバキュロウイルスの増幅は何時間で行なっていますか？

バキュロウイルスが感染しません 削除/引用 No.7769-1 - 2019/03/15 (金) 01:35:35 - だいちょうきん 平素は大変お世話になっております。 バキュロウイルス発現系を利用して、興味ある組換えタンパク質を分泌タンパク質としてSf21昆虫細胞で発現させようとしています。 6ウェルディッシュに播種したSf21にバクミドをトランスフェクションし、その48時間後の培養上清（濃縮せず、これを10 ulを1ウェルにアプライしました）を電気泳動したところ、驚いたことに5 ugのものがCBB染色で検出されました。つまり、P1ウイルス液の時点で5 ug/10 ul＝0.5 mg/mlとなりました。 これで十分実験に使える分が確保されたのですが、一応ウイルスの増幅を行いたく、このP1ウイルス液を未感染Sf21に感染させました。x1、x3、x9、x12と希釈しましたが、どの細胞も”感染していない”ようでした。 その根拠は1.　細胞が死なない。2.　タンパク質を作っていない。 です。 つまり、Sf21にバクミドをトランスフェクションすると確かに欲しい物は大量に作ってはくれましたが、感染可能なバキュロウイルスは作出されていないように思えます。 ”ウイルスタイターが上がらない”もしくは”ウイルスができない”というトラブルでトラブルシュートを探しても該当する項目が見つかりませんでした。 P1で確かにこと済ませてますが、ウイルスが出来ていない理由がわかりません。 できれば納得して先に進みたいので、ご意見ありましたら宜しくお願いいたします。

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