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(無題) 削除/引用 No.7793-12 - 2019/03/30 (土) 09:45:22 - Yakuriman ＞＞F様 現在扱っているPGが分解性がきわめて高いものという意味です。 共同研究の先生も断頭直後に液体窒素につけてサンプリングするなどしていたそうなので、実験手技的にも難しいかなと。 PGを測定する安価で確実な方法があればよいのですが。。。 ＞＞おお様 その通りですね。 他の脳部位についてもサンプリングを進めてみます。

(無題) 削除/引用 No.7793-11 - 2019/03/28 (木) 21:24:38 - おお プロスタグランジンということですが、合成酵素をRTPCRで検出するという事は先の議論と同様で合成されている場所が必ずしも病変を示す場所ではない可能性がありますよね。 ただやってみてからの議論なのかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.7793-10 - 2019/03/28 (木) 13:11:31 - F ＞ELISAについて ＞実は測定しようとしている炎症因子がプロスタグランジンでして、分解性が高く、直接の測定は難しいと言われています（共同研究者の先生も直接の測定はハードルが高いとおっしゃっています）。 直接の測定というのが不明ですが、組織からのPG抽出は多くの論文で報告されているはずです。私も脳を含めたいくつかの組織から主にPGE２を抽出し、ELISAで測定しています。もちろんすべてのPGでうまくいくかはわかりませんので、論文や書籍を調べてみるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7793-9 - 2019/03/28 (木) 10:37:46 - Yakuriman 皆様、ご返答ありがとうございます。 ＞＞み様、 針刺しについて アドバイスの通り、検討してみます。ありがとうございます。 既報の方法について 既報では、組織のライセートを用いております。同様の組織抽出物なので、炎症因子の発現上昇が観察されてほしいのですが...。 ELISAについて 実は測定しようとしている炎症因子がプロスタグランジンでして、分解性が高く、直接の測定は難しいと言われています（共同研究者の先生も直接の測定はハードルが高いとおっしゃっています）。 合成酵素や代謝酵素などの蛋白レベルをELISA で測ることも考えられますが、高価なキットのため、なかなか購入に踏み切れておりません。 抗体は共同研究者から分与できるかと思いますので、ひとまずWBで検討してみます。ありがとうございます。 ＞＞AP様 逆転写のプライマーについて 研究室で汎用しているランダムプライマーを用いております。 サイトカインmRNA発現量測定の際はなにか特殊なものが必要なのでしょうか？ ＞＞おお様、 貴重な情報ありがとうございます。参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.7793-8 - 2019/03/27 (水) 23:51:10 - おお >[Re:6] おおさんは書きました : > わたしもタンパクを見るのがいいのかなとおもってます。結局タンパク発現の上昇はPost transcriptionalで起こる事もまあまああるでしょうから。 TNF（たしかTNFだったと思う）のばあいは核でPre-mRNAの状態で保持されていて、刺激でスプライシングと核からのTranslocationがおこるという報告もあったと思います。

(無題) 削除/引用 No.7793-7 - 2019/03/27 (水) 22:40:51 - AP 念のため聞きますが逆転写のプライマーは？

(無題) 削除/引用 No.7793-6 - 2019/03/27 (水) 22:12:43 - おお わたしもタンパクを見るのがいいのかなとおもってます。結局タンパク発現の上昇はPost transcriptionalで起こる事もまあまああるでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.7793-5 - 2019/03/27 (水) 18:25:47 - み >[Re:4] Yakurimanさんは書きました : > ご指摘のとおりですね、、、 > しかし、サンプリングではなく、たとえば saline（control)の投与時の針刺しによるエフェクトなどは考えられないでしょうか？ > 幼若期のマウスですし、可能性はあるかなと...。 投与なし（無処理）の同週齢マウスと比較すれば針刺し生食投与による影響の有無は調べられるでしょう。 PFCサンプルでIL6, TNFをELISAで調べた論文は脳脊髄液を採取しているのでしょうか？それとも組織抽出物を用いているのでしょうか？ 同じ方法でELISAしてみるのが手っ取り早そうだけど。

(無題) 削除/引用 No.7793-4 - 2019/03/27 (水) 17:00:43 - Yakuriman 皆様、ご返答ありがとうございます。 >> み様 �@ そのような短時間のサンプリングでILやPGSのmRNA変動を惹起するとは思えない。c-fosなどの最初期遺伝子ならチンタラサンプリングしていると上昇するとは思うけど。 ご指摘のとおりですね、、、 しかし、サンプリングではなく、たとえば saline（control)の投与時の針刺しによるエフェクトなどは考えられないでしょうか？ 幼若期のマウスですし、可能性はあるかなと...。 �AそのモデルマウスでPFCに存在する細胞（neuron, astrocyteやinfiltrated inflamatory cellsのいずれか)がILやPGSを発現亢進するという事実（既報）は存在するのか？血中の炎症性サイトカインが上昇したりPFCで障害が出ていたとしてもサイトカイン産生細胞がPFCに存在するとは限らないと想像する。 既報では、PFC における IL-6 や TNF-a の産生量の上昇（ELISA での検討）が確認されておりますが、 産生細胞が PFC に存在するかは検討されていませんので、おっしゃる通りかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7793-3 - 2019/03/27 (水) 15:00:07 - おお そうだなぁ。サイトカインなら発現している細胞が必ずそこにあるとは限らないなぁ。またそこに発現しててもごく一部の細胞だったら全体では上がっていないように見れるだろうし・

(無題) 削除/引用 No.7793-2 - 2019/03/27 (水) 14:10:58 - み >[Re:1] Yakurimanさんは書きました : > 私は行動変化が見られていることから polyI:C による炎症イベントは生じているものの、サンプリングの過程でおきる炎症によりサイトカイン量の上昇がマスクされているのではないかと考えています。 > > 今現在は、すべて on ice で 断頭 ⇒ 脳出し ⇒ ブレインマトリクスで切断 ⇒ 炎症イベントが報告されている PFC をパンチング ⇒ 以下ホモジナイズ・RNA抽出という実験条件ですが、液体窒素やドライアイスを使用したほうが良いのでしょうか？？ �@そのような短時間のサンプリングでILやPGSのmRNA変動を惹起するとは思えない。c-fosなどの最初期遺伝子ならチンタラサンプリングしていると上昇するとは思うけど。 �AそのモデルマウスでPFCに存在する細胞（neuron, astrocyteやinfiltrated inflamatory cellsのいずれか)がILやPGSを発現亢進するという事実（既報）は存在するのか？血中の炎症性サイトカインが上昇したりPFCで障害が出ていたとしてもサイトカイン産生細胞がPFCに存在するとは限らないと想像する。

【脳, 幼若マウス】炎症因子のmRNA発現量の測定について 削除/引用 No.7793-1 - 2019/03/27 (水) 13:38:34 - Yakuriman いつも拝見し勉強させて頂いております。 炎症性サイトカインの発現測定に関するトラブルについてご助言を頂きたく存じます。 当方、神経薬理学系の研究をしている大学院生です。 扱っているテーマに「炎症性サイトカインと発達障害の分子機構の解明」があります。 現在は、そのin vivo実験系構築のため、その第一段階として、自閉症モデルとして汎用される polyI:C 投与モデルを作成しようと試みています。 今回作成しようとしているモデルは、幼若期に polyI:C を皮下注射により連投するモデルです（何報か既報もあります。）。 現在、行動レベルでは４週齢で自閉症様の行動異常が観察されているため、おそらく炎症イベントは生じていると考えられるのですが、、、 qRT-PCR で polyI:C 投与をした幼若マウス脳においてプロスタグランジン合成酵素やILなどの mRNA 発現量の増加が観察されませんでした（Ct値自体は測定できます）。 また、投与後のタイムポイントの影響を考慮して複数のタイムポイントでサンプリング ⇒ 測定しましたが、コントロールとの間に差が見られません。 私は行動変化が見られていることから polyI:C による炎症イベントは生じているものの、サンプリングの過程でおきる炎症によりサイトカイン量の上昇がマスクされているのではないかと考えています。 今現在は、すべて on ice で 断頭 ⇒ 脳出し ⇒ ブレインマトリクスで切断 ⇒ 炎症イベントが報告されている PFC をパンチング ⇒ 以下ホモジナイズ・RNA抽出という実験条件ですが、液体窒素やドライアイスを使用したほうが良いのでしょうか？？ それとも何か抜本的にサンプリング方法を見直すべきでしょうか？ 炎症性因子の測定をされている方からご意見を伺えれば幸いです。

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