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アドバイスありがとうございます 削除/引用 No.781-14 - 2012/08/04 (土) 03:06:00 - salt AP様、~様へ 結果報告が遅くなりました。 重ね重ねの丁寧なアドバイス、誠にありがとうございました。 検出目的のバンドは、通常のBL6が6kbp,flox/floxが7kbp,ノックアウトが10kbpとかなり大きめのバンドの検出を目的としていました。 自分の場合は対象のマウスに完全な野生型のマウスを含んでおり、肝・脳・筋・尾と色々な臓器で試しましたが、やはり自身のプローブでは目的のバンドを検出できませんでした。 そこで、アドバイスの中にあった他の同僚のプローブを使用するというのを行ってみたところ、 1kbp前後に明瞭なバンドを検出することができました。 このため、少なくとも制限酵素処理とブロッティングまでは上手く行えていることが確認できたと考えています。 wash時間は実は6時間まで増やしてみたのですが、やはり全体的に薄くなるだけで検出できずでした。 どうやらプローブに問題があるのではという気がしてきています。 一応もともとのノックアウトマウス作成元から頂いたプローブではあったのですが… このため、残りのプローブをシーケンスして目的とする配列をきちんとふくんでいるかどうかを再検討してみようと考えています。 とりあえずご報告までです。 色々とアドバイスを頂きありがとうございました。知らないことも多く、大変勉強になりましたm(_ _)m

(無題) 削除/引用 No.781-13 - 2012/07/27 (金) 23:55:04 - AP もう一点、 精製したゲノムDNAは最終的にエタノール沈殿で回収していると思いますが、沈殿を乾燥させすぎていないでしょうか。そうすると再溶解が難しくなります。 自然乾燥でアルコールを飛ばすだけ、沈殿が少々湿っているくらいで溶解する感じでしょうか。アスピレータでアルコールをきれいに吸いとって、あるいはガラス棒でDNAを巻きとって回収する方法なら滴るエタノールを軽くブロットして除いて、そのまま乾燥させずに溶解するなんてこともあります。

(無題) 削除/引用 No.781-12 - 2012/07/27 (金) 14:25:27 - AP >プローブやDNA検体はその同僚のものを使っていました。なので試しておりません。 でしたら、自分のblotをworkしているプローブで検出してみるのと、その逆の組合せをやってみるといいですね。 >知識不足でお恥ずかしいかぎりですが、他のworkしているプローブで検出を行うと、「今まで使用していたプローブによる目的のバンドとは位置の違うなんらかのバンドが検出される」というのが結果予想で宜しいでしょうか？この場合はプローブの問題を疑うということで宜しいのでしょうか？ ブロットに問題がなく、使用したプローブの特性でスメアになっているとしたら、workするプローブで見ればスメアにならないはず。どんなサイズ、どんあパターンのバンドがでるかはあまり問題ではなく、スメアにならずちゃんとバンドが見えるかどうかです。 電圧に関しては、ゲルサイズ、wellサイズとか電極間距離、泳動距離なんかが分からなければ論議する意味があまりないと思います。よく言うのは、電極間とかゲル長1 cmあたり10 Vとか低電圧で分離を良くする場合で2-3 Vとかですかね。数ugくらいのゲノムDNAならmupidの標準サイズのwellでも分離できて、まあ念のため50 Vにしますが、100 Vでもそれほど問題ないと思いますよ。 どっちにしろ、泳動電圧の問題で、バンド本体が判別できないようなスメアになることはないでしょう。

横から 削除/引用 No.781-11 - 2012/07/27 (金) 13:05:36 - ~ >他のworkしているプローブで検出を行うと、「今まで使用していたプローブによる目的のバンドとは位置の違うなんらかのバンドが検出される」というのが結果予想で宜しいでしょうか？ ご存知かと思いますが、サザンブロット解析は、制限酵素処理して短くしたDNAをアガロースゲル電気泳動でサイズごとに分け、それをメンブレンに移しとり、そのメンブレン上の特定のDNA配列と結合するプローブを結合させてシグナルを検出する手法です。 そのため、他のworkしているプローブで検出を行うと、そのプローブが結合するサイズのDNAのある位置にシグナルが検出されます。 その位置が今まで使用していたプローブによるシグナルの位置と異なると予想するためには、各プローブが認識するゲノムDNA断片の長さの情報が必要です。 >この場合はプローブの問題を疑うということで宜しいのでしょうか？ 他のプローブで期待されるシグナルが検出される場合、おそらくは当該サンプルのゲノムDNAの調整や制限酵素処理、電気泳動、メンブレンへのトランスファー、ハイブリダイゼーション、検出等の一連の作業は適切に行われていると考えられるでしょう。 プローブのみを変えた場合に問題が生じるのであれば、プローブに問題があると考えるのが妥当でしょう。 >泳動は90Vx5hrですが、少し電圧が強いのでしょうか？ 電圧よりも時間数が長いことが心配ですが、一緒に流している分子量マーカー(kb ladderやλ/Hind III)の12kb以上のバンドとと7kb以下のバンドが適切に分離されているのであれば、電圧に問題はないと考えていいかと思います。 >ゲル泳動EtBr染色ではサテライトバンドなしでスメアであってもハイブリを行うとバンドが出るということは普通にあることなのでしょうか？ 前提として、同僚の方のサンプルはサテライトバンドなしでシグナルを検出できているのですよね？ それを踏まえたうえで、今の泳動ではゲル内に何bpのDNAまでが残っているのでしょうか？5時間も流しているので、低分子DNAはあまり残っていないと思いますが。 サテライトDNAは、制限酵素認識サイトを含む繰り返し配列由来の同じ長さのDNA断片によるバンドですよね。 基本的には低分子がほとんどかと思いますが、マウスゲノム＋BamHIの組み合わせで、5時間泳動した後にゲルに残っているどのサイズのサテライトバンドを期待しているのでしょうか？

皆様のアドバイス誠にありがとうございます�A。 削除/引用 No.781-10 - 2012/07/27 (金) 11:03:44 - salt 続きになります。 一部訂正です。前回投稿の文章でEcoRIは制限酵素ですね。申し訳ございません。 AP様へ >自分のblotを、workしているプローブで検出してみるというのはいい手です。 すいません、他の同僚の検体で〜のくだりはあくまで私の手技確認の面が大きくプローブやDNA検体はその同僚のものを使っていました。なので試しておりません。 知識不足でお恥ずかしいかぎりですが、他のworkしているプローブで検出を行うと、「今まで使用していたプローブによる目的のバンドとは位置の違うなんらかのバンドが検出される」というのが結果予想で宜しいでしょうか？この場合はプローブの問題を疑うということで宜しいのでしょうか？ >continuousなスメアは不完全消化とか〜、 今回はゲル泳動の時点でスメアのままであったという状況でしたので、次回はハイブリダイゼーションまで進めようかと考えています。 泳動は90Vx5hrですが、少し電圧が強いのでしょうか？成書だと30Vで〜と書かれていて少し気になっています。 後、ゲル泳動EtBr染色ではサテライトバンドなしでスメアであってもハイブリを行うとバンドが出るということは普通にあることなのでしょうか？ 他の制限酵素も試してみようと思います。 >BamHIはTakaraではKを推奨していますが〜 了解しました。確かに当初教官に薦められたH、添付のKと変えましたが、結果には違いがみられませんでした >ちゃんとworkするプローブならハイブリ条件、洗いの条件が少々悪くてもスメアになんかなりませんから、ここの条件を振って解決しようとするのは無駄骨です。 こ、これは…マウス供与元の研究室のサザンも比較的バンドが薄く検出されていたので、スメアの中に隠れてバンドが見えないのだろうというのが教官の予想のようです。ですので、実はハイブリバッファーをo/nのUltra hybriに変更および洗いの時間を1hrx4回を1hr×6回とか増加してやってみよということでした。ますますプローブが怪しくなってきますね… >ただ、制限酵素が全く効かなければ、巨大なDNAが残りそもそもゲル中を泳動されないよとのことで、 これも確かに自分で試してみたらよいですね。早速やってみます。DNA抽出はフェノクロなので特殊ではないと思います。 >問題なければ水でもいいんですが〜。 実はTEは御記載の影響を気にして使用不可となっていました… >TEからのEDATの持ち込みより制限酵素消化バッファーに含まれるMgのほうが〜 次の抽出からTEを使用しようと思います。 様々なアドバイスを頂き誠に本当にありがとうございますm(_ _)m 進行が遅くてあれですが、それぞれ条件を検討してやってみようと思います。 また、結果はご報告したいと思います。

皆様のアドバイス誠にありがとうございます�@。 削除/引用 No.781-9 - 2012/07/27 (金) 10:40:19 - salt 忙しい中にも関わらずアドバイスを下さった方々、誠にありがとうございます。 ~様へ >問題があるのは泳動の前か後か：サザンのコントロールとなるプローブがラボにあるのではないでしょうか？ これは初耳でした。早速コントロールになるプローブがあるかどうか早速調べてみようと思います。 >サテライトバンド検出の必要性：これは幸いにも他の同僚のでは検出されました。 >プローブに問題がないか：これはやはり問題点として挙がってきますね。手技やその他の試薬の良しあしを確認したかったので、後者であります。ですので、プローブそのものの問題があることは否定できていません(もともとのECORI株自体はマウス供与元の研究室からもらいましたが精製は自分のラボです) CIAP様へ 御指摘の通り、他のプラスミドは消化できました。なので、制限酵素はきちんとワークしているようです。ありがとうございます。 続きます。

(無題) 削除/引用 No.781-8 - 2012/07/27 (金) 10:02:18 - AP 自分のblotを、workしているプローブで検出してみるというのはいい手です >＊ちなみに他の同僚の検体でもってサザンを行ったのですが、こちらは普通に上手くいきました。 というなかで、もう試されているのかもしれませんけれど。 プローブに単純な配列やrepetitive sequenceが含まれていると、cross hybridizationでスメアになる可能性はあります。 ただし、クロスハイブリの場合はむしろラダーになることが多くて、continuousなスメアは不完全消化とか、あるいはオーバーロード、DNAのアグリゲーションなどの電気泳動の分離の問題のほうが可能性が高い気がします。 ・目的のgenotypingにはBamHIが適しているのでしょうかれど、とりあえず他の酵素、EcoRIなんかで試してみては。 ・BamHIはTakaraではKを推奨していますが、他社ではHを薦めていたり専用バッファー（たとえば150 mM NaClの）を付けていたりします。まあ、結構、条件にうるさくない酵素なので、そのへんの問題ではないでしょう。 ・ちゃんとworkするプローブならハイブリ条件、洗いの条件が少々悪くてもスメアになんかなりませんから、ここの条件を振って解決しようとするのは無駄骨です。 >ただ、制限酵素が全く効かなければ、巨大なDNAが残りそもそもゲル中を泳動されないよとのことで、 これはうそでしょう。よほど特別な手法を使わない限り、抽出されたゲノムDNAはそんなに巨大ではありません。機械的せん断によって数十からせいぜい数百kb前半台に断片化して、ウェルに残るようなことはありません。試しに、未消化のゲノムDNAサンプルを泳動してみるといいです。逆にもし、ウェルに残るようだったら完全に溶解しきっていずゲル上の塊になっていたり、タンパク質などの不純物が邪魔をしているのでしょう。 >ゲノムDNAは精製した後に、ddH2Oに溶解していますが、確かにうちのプロトコールですと、65℃x1hrとなっています。 問題なければ水でもいいんですが、溶解に問題がある可能性がるので、10 mM Tris pH 8のようなバッファーにしてみては。やはり水だとちゃんと溶けにくいです。制限酵素消化へのバッファーの持ち込みは気にしなくていいです。なんならTEでもいいくらい（DNAが二価金属塩を作っていると溶けにくいのでキレート剤があったほうがDNAはよく再溶解します。TEからのEDATの持ち込みより制限酵素消化バッファーに含まれるMgのほうが大過剰なので、遜色なく酵素は効きます）。

(無題) 削除/引用 No.781-7 - 2012/07/26 (木) 20:50:21 - CIAP 制限酵素は買い換える前に、何か他のプラスミドを消化してみては？ うちも2年前に切れたHindIII使ってますけど、しっかりワークしてます。

(無題) 削除/引用 No.781-6 - 2012/07/26 (木) 15:12:23 - ~ 問題があるのは泳動の前か後か： そのような実験をされているのであれば、適当なコントロールとなるプローブがラボになるのではないでしょうか？それで当該サンプルと同僚の方のサンプルををサザンブロット解析することにより、泳動終了の時点より前で問題が起こっていることが確定できますね。 サテライトバンド検出の必要性： 他の同僚の方のサンプルを使った場合では、サテライトバンドが見えたのでしょうか？ プローブに問題がないか： 他の同僚の方のサンプルは、もらったプローブを使ったのでしょうか？それとも、その同僚の方の使われているプローブを使ったのでしょうか？ 前者であれば、プローブに問題がないことが確認できますね。 後者であれば、プローブに問題があることが否定できませんよね。

結果のご報告になります 削除/引用 No.781-5 - 2012/07/26 (木) 13:08:58 - salt total20μlにgDNA 1μgとして、それに高濃度BamHI(50U/μl)を1μ入れて、TakaraのBamHI推奨温度の30℃にて、1o/nおよび2o/nで制限酵素処理を行ってみました。途中処理開始後2hrと10hrでタッピングして内容物は攪拌致しました。 結果としては、今回もスメアを引いてしまい、やはりサテライトバンドが見当たらない状況でありました。 制限酵素処理の過程としてはかなり念を入れたつもりではありますが、もともとのマウスの提供元の先生にどこのメーカーのBamHIを使っていたか聞いてみるとともに、BamHIが2年前のものと少し時間が経っているため、新しく購入しなおそうかと考えています。 他に何か検討した方がよい方法など、あるようでしたらご助言頂ければ幸いですm(_ _)m

お返事ありがとうございます。 削除/引用 No.781-4 - 2012/07/22 (日) 00:32:05 - salt AP様へ アドバイスありがとうございます。 >一般的にvortexは制限酵素を失活させます。 了解しました。撹拌の際はご教授頂いた方法を試してみたいと思います。 >10x buffを1/20 volというのは計算が合いませんが、、、、 すいません間違えましたm(_ _)m。10xBufferは2μlいれておりますので、volumeは大丈夫です。なので、total20μl中にgDNAが10μg入っております。 >制限酵素消化が不完全なのだと思います。ゲノムDNAは粘性が高かったり、完全に溶解していなくて酵素がアクセスできなくて制限酵素が効きにくいです。 御指摘ありがとうございます。ゲル泳動後の時点でスメアを引いてサテライトバンドも出なかったのでこの点がかなり気になっていました。ただ、制限酵素が全く効かなければ、巨大なDNAが残りそもそもゲル中を泳動されないよとのことで、この点に関してはスルーされていました（それで気になって自分で少し条件を変えていじってました。） 御指摘頂きました、gDNAの濃度を減らして消化し、EtOH沈殿して再溶解する、という操作および制限酵素消化中にかき混ぜる操作を追加して行ってみようと思います。 >そもそも精製したゲノム」DNAがちゃんと溶けていない可能性が高いので（さらさらの部分と粘性が高くて塊になっている部分があったりしませんか） 御指摘ありがとうございます。 ゲノムDNAは精製した後に、ddH2Oに溶解していますが、確かにうちのプロトコールですと、65℃x1hrとなっています。 RTxO/Nを追加してよりきちんと溶解するようにします。 いずれもまだ試してない方法でありました。上記操作を追加して、TBEゲル泳動後の時点で、スメアやサテライトバンドの状態がどうなるか確認してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.781-3 - 2012/07/22 (日) 00:16:14 - AP >Vortexをかけて良く混ぜるようにしたりとやってみました 一般的にvortexは制限酵素を失活させます。 ピペットチップやガラス棒（ガラスキャピラリーの穴を焼き潰ししたものなど）でかき混ぜるか、優しくタッピングするのがいいです。

(無題) 削除/引用 No.781-2 - 2012/07/22 (日) 00:11:18 - AP 制限酵素消化が不完全なのだと思います。 ゲノムDNAは粘性が高かったり、完全に溶解していなくて酵素がアクセスできなくて制限酵素が効きにくいです。 >�A制限酵素切断はTaKaRaのBam HI(高濃度)を1μl(=50U)+10μgのDNA、10xK Buffer(メーカ添付推奨Buffer)1μl+DDH2Oでtotal 20μlとして、 10x buffを1/20 volというのは計算が合いませんが、、、、 10-20 uL中に10 ugのゲノムDNAというのはかなり濃くてトラブルのもとです。 ・ゲノムサザンは適切に行えば1 ug もあればほ乳類ゲノムでシングルコピーの配列を検出できます。DNA量を減らしてみましょう。 ・ボリュームを10倍以上大きくしてDNA濃度を下げて消化し、EtOH沈殿してロードボリュームに再溶解する。 ・制限酵素消化中に時々かき混ぜる。消化が進むと粘性が下がりDNAが分散しやすくなるので、そこで撹拌して溶けきってないDNAを溶かし酵素がアクセスしやすくする。必要に応じて途中で酵素を追加する。 ・そもそも精製したゲノム」DNAがちゃんと溶けていない可能性が高いので（さらさらの部分と粘性が高くて塊になっている部分があったりしませんか）、十分時間をかけて（一晩以上）均質になるまで溶かす。

サザンでスメアをひいてしまい、目的のバンドがでません 削除/引用 No.781-1 - 2012/07/21 (土) 23:49:38 - salt お世話になります、saltと申します。 もし、お時間が頂けるようでしたら下記の点についてお知恵を拝借出来れば幸甚です。 現在、目的の遺伝子を筋特異的にKOしたマウスを使って、その遺伝子がなくなると筋肉にどのような影響がでるかについて研究を行っています。 genotyping目的のPCRでは研究に使用するマウスがflox/floxの配列を持ち、筋肉特異的Cre遺伝子の導入もできているのですが、マウスから実際に筋肉をとってきてサザンを行うと、WT、flox/floxのみ(Cre-)、KO、の3種類でいずれも筋肉・肝から抽出したDNAのサザンでは目的としているバンドが検出できていません。このため、実際にワークしているのかどうか確証がもてない状況です。 前情報として、もともとこのfloxマウスを頂いた研究室では、肝培養細胞にアデノでCreウイルスを導入して、その細胞から抽出したDNAでサザンを行い（制限酵素はBam HIを使用）、WT、flox/floxのみ(Cre-)、KOでそれぞれ異なるバンドを検出できています。 そして、プローブに関しては直接この研究室から頂いております。 手順としては、 �@DNAはProteinase Kで組織を融解して、フェノクロ抽出（検体を凍結粉砕してからProKに入れたりしました）。 �A制限酵素切断はTaKaRaのBam HI(高濃度)を1μl(=50U)+10μgのDNA、10xK Buffer(メーカ添付推奨Buffer)1μl+DDH2Oでtotal 20μlとして、1 O/N、37℃で行っています。 （ここは教官の勧めで10xHigh Bufferを使ったり、後は自分なりにカット時間を2 o/nとしたり、実験医学別冊の方法をみて制限酵素を100Uまで増量し、カット開始後1-2hrおよび12hr後にVortexをかけて良く混ぜるようにしたりとやってみました） ただ、ホットバスの温度が一定しないみたいで、42-43℃となっていることが多いです。TaKaRaの添付文書だと 至適反応温度が30℃なのですが、Bam HIは温度の違いで上手くきれなかったり、またスター活性が出やすくなったりしますでしょうか？ �B0.8%TBEアガロースゲルで90Vx5hr泳動。目的バンドが12kbpと7kbと大きいのでかなりながく泳動しています。 ⇒EtBr染色して紫外線を当ててみてみると、この時点で筋・肝・尻尾のいずれの検体でも全てスメアを引いてしまいます。サテライトバンドも検出されません。 �C10xSScでhybond Nにo/nトランスファー⇒UV cross linkを行う。 �DRapid-hyb Bufferを使用して、65℃x50分でプレハイブリ。 �E新鮮な32Pおよび前述のfloxマウス提供元から頂いたプローブ（20ng/μl）を1.5μlを使用して、Rapid-hyb Bufferで65℃x2hrでハイブリ。 �F洗いは20分×2回〜1hr×4回まで色々試しました（一応、スメアを引いたレーンがとても濃いせいでバンドが見えないのかと考え、洗いの時間を長くしましたが、バックは薄くなりますがバンドは出ず…） 洗いとハイブリの最中は65℃から温度が下がらないようにかなり細心の注意を払って作業しました。 �G画像はX線フィルムではなく、BAS2500というカートリッジ？に転写して、Typhoon FLA7000で解析。 ＊ちなみに他の同僚の検体でもってサザンを行ったのですが、こちらは普通に上手くいきました。 現状では上と相談して、Ultra-hybri Bufferを使用して、42℃,o/nでハイブリダイゼーション(これは前任者がやって失敗済)、洗いをさらに長くしてレーンを見えないレベルまで洗い、X線フィルム×2-3日感光、プローブの再作成、などを考えています。 正直、かなり行き詰ってしまっており、なにか手がかりを頂ければと思いご相談させて頂く次第です。何卒宜しくお願い申し上げます。

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