Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

[至急お願いします]　血球由来のノンスぺ トピック削除
No.7845-TOPIC - 2019/04/25 (木) 14:54:22 - ダメノンスぺ
皆様

お世話になっております。

先月からマウス腸管の蛍光免疫染色を行っております。
Alexa488がダイレクトラベルされた標的タンパク質に対する抗体を一次抗体として使用しています。
そもそも標的タンパク質に対する抗体のダイレクトラベルのシリーズはAlexa488しか販売されていません。(Cy5系は売っていません。)

実際に染色してみますと赤血球？血球由来の細胞がかなり染まっていました。
標的タンパク質は血球系には発現していません。

そこでお聞きしたいのが血球系由来のノンスぺ？自家蛍光？を弱くする方法をご存知の方がいましたらご教示いただきたいです。

Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kitなどの自家蛍光抑制剤を購入した方がいいのか？と考えています。

ちなみに、アルデヒド系で固定しているので、一次抗体反応前に
50ｍM NH4Cl in PBSで10分間反応させましたが、特にノンスぺが薄くなるということはありませんでした。

マウス：9週齢
切片：パラフィン組織切片
賦活化：クエン酸バッファー
ブロッキング：ブロッキングワンヒスト（ナカライ）
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.7845-6 - 2019/04/30 (火) 11:43:49 - ダメノンスぺ
>crfgtvbhjんk 様

論文ありがとうございます。
SBBは使ったことないので大変参考になりました。
この論文を参考にされてみて実際はどうでしたか？


>AP 様
EDTA処理も検討にいれたいと思います。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.7845-5 - 2019/04/27 (土) 14:13:49 - AP
>EDTA処理というのは賦活化に用いるバッファーをEDTAにすれば良いのでしょうか。

理屈から考えただけで実際にやったことはないですよ。
どっかの段階でEDTAを混ぜといたらどうかなと。
例えば賦活化のクエン酸バッファーにでも。

(無題) 削除/引用
No.7845-4 - 2019/04/26 (金) 20:59:00 - crfgtvbhjんk
とりあえずこれ読んでみて。

Autofluorescence and Nonspecific Immunofluorescent Labeling in Frozen Bovine Intestinal Tissue Sections: Solutions for Multicolor Immunofluorescence Experiments
Jenvey CJ et al. 2017 ;65: 531-41.

(無題) 削除/引用
No.7845-3 - 2019/04/26 (金) 19:56:18 - ダメノンスペ
>AP様

ありがとうございます。

まだ抗体無しをやっていないのですが、
一応、488以外のRFPやCy5に対応するフィルターで見てみたのですが、
血球系がビカビカに光っていました。

EDTA処理というのは賦活化に用いるバッファーをEDTAにすれば良いのでしょうか。

よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.7845-2 - 2019/04/25 (木) 18:37:20 - AP
揚げ足取りから入るみたいですが、
直接標識なら一次抗体とは言わないでしょう。二次はないんだから区別の必要がない。

>血球由来の細胞がかなり染まっていました。
染まっているのは確かなんでしょうか。光っているのは確かだろうけど。
つまり抗体の非特異的反応なのか、自家蛍光なのか。
ご自身も？でどちらかはっきりしていないようですが、そこは切り分けられるはず。
抗体染色ないで見ても光るか、
Alexa488のフィルターセット以外でも変えても光るか、

おそらくヘモグロビンに配位しているポルフィリンの自家蛍光だと想像できますが。ポルフィリンは有機溶媒で溶出しやすいので手順によって気にならないものですけど。パラフィン切片ならアルコールも有機溶媒もくぐってますね。
もしポルフィリンであれば配位している金属（ヘモグロビンなら鉄）を引っこ抜けば光らなくなるはずですからEDTA処理なんかききそうな気がします。

[至急お願いします]　血球由来のノンスぺ 削除/引用
No.7845-1 - 2019/04/25 (木) 14:54:22 - ダメノンスぺ
皆様

お世話になっております。

先月からマウス腸管の蛍光免疫染色を行っております。
Alexa488がダイレクトラベルされた標的タンパク質に対する抗体を一次抗体として使用しています。
そもそも標的タンパク質に対する抗体のダイレクトラベルのシリーズはAlexa488しか販売されていません。(Cy5系は売っていません。)

実際に染色してみますと赤血球？血球由来の細胞がかなり染まっていました。
標的タンパク質は血球系には発現していません。

そこでお聞きしたいのが血球系由来のノンスぺ？自家蛍光？を弱くする方法をご存知の方がいましたらご教示いただきたいです。

Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kitなどの自家蛍光抑制剤を購入した方がいいのか？と考えています。

ちなみに、アルデヒド系で固定しているので、一次抗体反応前に
50ｍM NH4Cl in PBSで10分間反応させましたが、特にノンスぺが薄くなるということはありませんでした。

マウス：9週齢
切片：パラフィン組織切片
賦活化：クエン酸バッファー
ブロッキング：ブロッキングワンヒスト（ナカライ）
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。