マウス組織をホルマリン固定して作製した組織スライドで免疫染色を行っています。
今回は 新規抗体に変更していますが、過去に他の抗体で成功したプロトコルにならって、抗体以外の設定は変更しておりません。
FFPEスライドですので、ペルオキシダーゼのステップは飛ばしています。ブロッキングは1次抗体反応と同時に行っています。抗体反応は4℃オーバーナイトです。
結果的に、標的タンパク質の存在する細胞膜はしっかりそまっているのですが、それと同時に、非特異的に細胞内の粘液溜まりが顆粒状に顕著に染まります。1次抗体だけ変更していますので、2次抗体以降は問題ないと愚行しております。また、詳細なプロトコルの記載はないのですが、他の論文の画像を見る限り粘液が顕著に染まっていることもなさそうです。
質問としては、
@ブロッキング反応は時間を分けて確保した方がいいのでしょうか？
A4℃オーバーナイトとRT1時間はどちらがいいのですか？RTの方がいいケースも存在するのですか？
B粘液溜まりが顆粒状に染まる現象はFFPEでは起こることなのでしょうか？ |
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