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(無題) 削除/引用 No.7868-6 - 2019/05/09 (木) 17:03:14 - AU いくつか方法はあると思います。 1、WBとかたんぱくレベルで示す 2、Amplicon sequenceで、どれくらいdeletionがあるか調べる （次世代シーケンサー必要、外注がいくらかは知らないです。海外なら10ドル前後） 3、2の安価版、Sanger sequenceして解析ソフトで切れてるか確認する。 　　以下のサイトなら無料 https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis 4、そこそこのdeletionあれば、mRNAが不安定となるので、標的を外してqPCR 5､ Single clone拾ってTA-clonig+sequence レベルによりますが、3,4は、それだけだとReviewで叩かれそうですが、あって無駄な結果でもないと思います。 2がおすすめですが、できない環境ならコストを考えて、まず3をします。 少なくてもsgRNAの配列が機能してるか、検討できます。

(無題) 削除/引用 No.7868-5 - 2019/05/07 (火) 18:37:54 - asan どうしても評価しづらいというなら、sgRNAを二つ噛ませてexonのdeletionを起こすとかして、 PCRベースで評価するとかやりようは色々あると思いますが。 ま、CRISPRが出てきてそれなりに評価スタンダードが確立されてきてると思うのでカエルを用いてる 論文を参考にしてレビューで叩かれないように満足のいく自分の納得のいく評価してください。

(無題) 削除/引用 No.7868-4 - 2019/05/07 (火) 14:55:42 - 生化学 最終的に何を示せば KD を証明できるかを考えてみましょう。 しのごの理屈を言うよりもやっぱタンパク質の発現量です。 抗体を買わなければならない、とぼやいていては科学になりません。 この実験にあなたの人生のどれほどがかかっているか分かりませんが、私なら本当に必要な点なら自腹切って買ってでも証明します。

(無題) 削除/引用 No.7868-3 - 2019/05/07 (火) 11:50:58 - 培養細胞A 培養細胞でKOしていますが基本的に活性とウェスタンで見ています。 試行錯誤していたころはゲノムを取ってシークエンスを見たりもしていました。 シークエンスはターゲットの配列周辺をPCR後ベクターに載せて大腸菌へクローニングしてから行っていました。 おおむね単一の配列が検出できてはいましたが、それでもシグナルが重なりコンピュータでは上手く解析できないことが時々ありました。 それでも自分でシグナル見てindelが入ってそうかくらいは分かりましたが。

(無題) 削除/引用 No.7868-2 - 2019/05/06 (月) 21:04:42 - 独り言 T7 Endonuclease I (T7EI) mismatch assaysをしてはどうでしょう。 なぜかKitなるものが売られてますが、普通に実験しているヒトなら、 kitを購入しなくてもT7 endonuclease Iだけ購入してPCRでゲノム目的部位を増幅し、mismatch特異的なT7で切断できれば、crisprによるin delが入っていたということを調べられます。 プロトコールはCRISPRの方法論の論文を探せば、乗っているはずです。 複数のsgRNAのどれが最も効率的かを調べるのに、よく使われています。 主にCRIPSRの効率を見るために使いますが、完全にすべてのアレルにindelが入ったのかまでは判別できません。 抗体が販売されているのであればウエスタンするのが一番あとくされないと個人的には思います。

CRISPR/Cas9におけるノックダウンの確認 削除/引用 No.7868-1 - 2019/05/06 (月) 18:22:01 - 加藤 最近アフリカツメガエルにおいてCRISPR/Cas9でノックアウト実験を行っています。 そこで困っているのが、ノックアウトが本当に起こっているのかのスクリーニングです。 sgRNAの設計の問題か編集効率が低く、また異質4倍体であり一方の遺伝子しかノックアウトできないせいか表現型にも現れにくいのかなと思います。 しかし、表現型に現れない時にどのsgRNAが効いているのか判断できません。 ウエスタンブロット法は抗体を買わないといけませんし、シークエンシングはモザイク状に変異が入った時にうまく検出できない気がします。 周りのツメガエルでCRISPR/Cas9をやっている人は、切断部位周辺に制限酵素の認識部位があるところを設定していると聞きましたが、設計できる配列がかなり狭まりますしうまいことその認識部位が潰れなければならないのでハードルが高そうな気がします。 そこでツメガエルのみならずCRISPR/Cas9でKOをしている方はどのように変異の確認をされているのでしょうか。

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