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(無題) 削除/引用 No.788-8 - 2012/07/30 (月) 15:06:23 - PCR小僧 PCRのホットスタートは、Taqに結合して酵素活性を阻害する抗Taq抗体が高温で不活化して（単に結合がはずれるだけでなく）PCR反応がスタートするのが原理でしょ。だから抗体は高温で（通常の蛋白と同様に）不活化するものとばかり単純に考えていました。

(無題) 削除/引用 No.788-7 - 2012/07/27 (金) 09:27:26 - よっしー 腹水をそのまま使っているのですか？ 抗体を精製して使った方がいいと思います． その際も当然アイソタイプコントロールを置くか，抗原を添加し競合阻害するどうかの確認が必要だと思います．

(無題) 削除/引用 No.788-6 - 2012/07/27 (金) 00:42:25 - う これは私の個人的な感想です。 >ちなみに100℃５分の熱処理では、不活性化できませんでした。 これで抗体が変性しないのは、変だなぁと思います。 以前、私も自分で精製した抗体が、あるタンパク質の中和抗体みたいだったので、 その特異性を何とか確認したく、色々やった時がありました。 その時、とりあえずの確認として同じような熱変性をやってみたのですが、 5mg/mlの抗体溶液(どの位抗体以外のタンパク質があるかは不明)では 遠心すると白い沈殿が見られまして、活性はなくなりました。 熱変性では、抗体以外の何かしらの不純物が中和活性を持っていて 抗体ではなくその不純物があたかも特異的な中和活性を示すように見せているだけ、 という可能性は否定できないので、抗原で抗体をブロックして特異性をみる ことは必須だと思いますが、 しかしながら、熱処理しても活性があるというのは、 その中和活性は本当に抗体の活性によるの？ と、疑わしく思います。 あくませ、個人の感想です。

(無題) 削除/引用 No.788-5 - 2012/07/26 (木) 09:19:50 - nanasi ＞教えてください。さん ありがとうございます。やはり、抗体だけ不活性させるのは難しいようですね。 ＞よっしーさん ありがとうございます。 マウスのascitesを 用いているので、抗体の活性による阻害なのか、あるいはascitesの細胞毒性による阻害効果なのかを判断したいと思っております。 ＞ (゜Д゜さん ありがとうございます。 ペプチドを使った拮抗阻害ですかね。 過去の論文をもう一度よく読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.788-4 - 2012/07/26 (木) 00:47:32 - (゜Д゜ 別に抗体変性させなくても、抗原蛋白質orペプチドで競合阻害されることをしめすとか、normal IgG (normalっていっても一応抗体だから自分の調べる蛋白質とは反応しないことは要確認だけどね）を対照群にするとかいろいろ出来る気がする。ていうか、非特異的な反応が疑わしい抗体でも、抗体を変性失活させたら、その非特異的反応も消えて、見かけ上はOKなデータになってしまう恐れがあるんじゃね。 いちばん簡単なのは似たような実験してる論文探して、よその人たちがどんな風にしてるかみて（それが自分的に理にかなったまともな方法と思えたらだけど）真似するのがいいんじゃないかな。実際、論文にするとき、既にだれかによってpublishされてる方法だと、そこにはあんまりつまらないケチ付けられないとういのは確かにあるとおもう。もちろんそういう傾向を迎合することが学問の進歩にいいことなのかどうかはまた別の難しい問題だけどね。

(無題) 削除/引用 No.788-3 - 2012/07/25 (水) 20:15:16 - よっしー 私はいつも抗体を使った実験をする際のコントロールとして，アイソタイプマッチした抗体を使っています． 教えてください。さんのおっしゃられている，抗原と前反応させた抗体でも良いように思います． 100℃５分の熱処理や2-ME,DTT処理ってタンパクを変性させて，どのようなコントロールとしたいのでしょうか？？？ 抗体の不活性化という言葉もイメージがわきません．

(無題) 削除/引用 No.788-2 - 2012/07/25 (水) 19:36:22 - 教えてください。 >中和活性のコントロールとして、IgG 抗体を不活性化させたいのですが、 その抗体が認識する抗原エピトープと予め混合させたものを、ウイルスと細胞がいるところに添加するのがよいのではないでしょうか？ 抗体「だけ」の不活化は、実際難しいと思います。 他の方のご意見はどうでしょうか。

IgG抗体の不活性化 削除/引用 No.788-1 - 2012/07/25 (水) 16:27:49 - nanasi はじめまして。 現在、中和活性のあるIgG抗体を用いて培養細胞へのウイルス感染阻害実験をしております。 中和活性のコントロールとして、IgG 抗体を不活性化させたいのですが、完全に不活性化させるにはどのような方法があるでしょうか？ ちなみに100℃５分の熱処理では、不活性化できませんでした。 また文献では、２-ME, DTTなどの還元剤では、IgG抗体は完全に不活性化されないらしいですが。 ご存知の方いらっしゃいましたら、ご教示ください。 よろしくお願いします。

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