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(無題) 削除/引用 No.7903-13 - 2019/05/24 (金) 08:58:04 - GLUT4 AA様ご返信ありがとうございました。 PITChの方がとっつきやすいんですね...意外でした。 両論文を比較すると PITCh：アッドジーンからPITCh専用にCRISPR-Cas9発現用に2つプラスミドを購入してインフュージョンで融合させ、ドナーテンプレートも作製する必要 HITI：一般的なCRISPR-Cas9発現用プラスミドと、ドナーテンプレートのみで準備完了 のような印象を持ちました。MMEJエンハンサーはN.Comに出ていますね。チェックしてみます。 実際に自分の実験で行うかどうかは別にして、これらの遺伝子導入方法の日進月歩には目を見張るものがありますね。

(無題) 削除/引用 No.7903-12 - 2019/05/23 (木) 11:03:07 - AA 私自身、同条件でHITI vs PITChの比較をしたことがあるわけでなく、 また試行回数もそれほど多いわけではないので私見になりますが、 HITIよりPITChのほうがとっつきやすい印象はあります。 準備もPITchのほうが楽なのではないかと思います。 PITChもMMEJエンハンサーもわかってきたので効率もかなりあげられるようです。 一方でうまく行っているケース同士を比較するとやはりHITIのほうが良さそうです。 増えない細胞への導入はHITIの強烈なポイントですし、結局の所は、 目的や合う合わないなどをみて、うまく使い分けている感じだと思います。

(無題) 削除/引用 No.7903-11 - 2019/05/23 (木) 02:53:26 - GLUT4 興味深く拝見しています。 HITIとMMEJ (PITCh)を比べた際にHITIの方が俄然効率が高いというのはここで取り上げられている論文に書かれてあります。私自身はゲノム編集を使ってノックアウト体は取っていますが、ノックアウト体は未経験です。AA様はMMEJを使われているようですが、ゲノム編集の界隈ではHITIの評判はどうなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7903-10 - 2019/05/22 (水) 11:07:33 - ノッキン AAさん、 何度も何度もコメントをいただきまして、ありがとうございます！ そうなのですね！良かったです。 まずpX330との違いを自分なりに調べた上で進めたいと思います。 この度は本当にご親切に教えていただき、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7903-9 - 2019/05/22 (水) 09:56:43 - AA px459に、U6-PITChガイド-U6-自分のガイド、と入れて使ってる人もいるので おそらく問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.7903-8 - 2019/05/22 (水) 07:40:42 - ノッキン AAさん、Natureプロトコル（2016）を読んで、自分のドナーテンプレートをデザイン出来ました。 一点もう一つお伺いしてもよろしいでしょうか？ すみません立て続けに投稿してしまい...。 All in one CRISPR-Cas9 vectorはpX330をベースに作製されていますが、これをpX458ベース（Cas9の他にGFPも発現します。）で行った方がトランスフェクション効率の低い細胞ではトランスフェクション後にGFP陽性をソートし、ピューロマイシンでさらに選択することでノックアウトのピックアップの可能性は高まりそうなものですが、いかがでしょうか？ それが可能かどうかはpX330A-1x2とpX458の違いがGFPの有無によるかどうかだと思えます。 pX330は私のラボで所有しておりまして、pX330とpX458はGFPの有無の違いだと理解しています。 なので、もしpX330A-1x2とpX330が同じもの（ナイチャープロトコルではgRNAとCas9発現用としか書かれてありませんでしたので、それってpX330と何が違うんだろう...と。）なら、pX458ベースでAll in one CRISPR-Cas9 vectorを作製した方がいいのかなと考えています。 非常に分かりづらい書き方で上手に伝わっているか懐疑的ですが、もしコメントをいただけるようでしたら幸いです。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7903-7 - 2019/05/22 (水) 03:59:27 - ノッキン AAさん、 引き続きコメント、アドバイスいただき感謝しております。 比率に関してありがとうございます。 テンプレートの方が多いのですね。意外でした。 PITCh法ではNature　ProtocolによるとCRISPRプラスミド1に対し、テンプレートはその半量でいいみたいですね。 PITCｈ法、今読んでいます。 図7のall　in　oneベクターは売られてはいないんですね（ですよね？）。 ではまず、Addgeneより、ｐX330A-1ｘ2とpX330S−2−PITChを購入し、前者へ私の遺伝子のｇRNAをクローニングし、ゴールデンゲートアッセンブリでall　in　oneベクターを構築するところから始めないといけませんね。 それから、ｐCRIS-PITChv2-FBLを購入し、EGFP-2A-PuroのPCR鋳型として持っておくと良さそうです。 私はタグを挿入することを目的としていましたが、EGFPやPuroRがあった方がずっとクローンを取りやすいですよね！ HITI法の効率の良さ（50％以上のノックイン効率）を信じていたので、そこまで考えが及びませんでした。 > ということですが、改変後にre-cutされるような設計にはなっていないでしょうか？ HITI法ではｇRNAの配列の向きを工夫することでre-cutを防ぐことができるので、それに関しては大丈夫だと思います。 AAさんとご相談させていただき、大変勉強になりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7903-6 - 2019/05/21 (火) 18:48:17 - AA ドナーDNA:CRISPRプラスミド=5:1くらいから始められるといいと思います。 もちろん、条件は振られたほうがより良いことはご指摘のとおりです。 >>誰がやってもうまく行っている というのはちょっと語弊があったかもしれません。 入れたい遺伝子座やトランスジーンの中身、腕の善し悪しなど いろんな条件が影響しますので、 「誰がやっても"最終的には"うまく行っている」、 というような捉え方をしていただければと思います。 PITChはhAAVS1のプラスミドなどはかなりうまく動いているようですし、 とかく、デザイン次第なのかもしれません。 ただ、培養実験は実験者の手技の影響をそもそも受けやすいので あまり方法の是非を論ずるよりは、自身にあっているかいないか程度で 判断するのがいいかもしれません。 ちなみに、 ex22-DSB-ex23-挿入配列 ということですが、改変後にre-cutされるような設計にはなっていないでしょうか？ donor中の認識配列該当部分は改変を加えるなりして、donor自体、 あるいは改変後のゲノムが切断されないようにする必要があります。

(無題) 削除/引用 No.7903-5 - 2019/05/20 (月) 23:46:55 - ノッキン AAさん、引き続きありがとうございます。感謝しております。 MMEJというのはPITIh法のことでしょうか。 名前は聞いたことはありましたが、具体的には知りませんでした。 HITI論文の図1にはビトロでノックイン効率を比較しています。 そこではHITI＞＞＞PITIh＞HDRという効率でした。 細胞はHEK293です。 これらのことからHDRやPITIhではなくHITIを試すに至りました。 ただAAさんが仰られた、”誰がやってもうまく行っている”というのにとても驚いています。 細胞株を樹立することが目的ですので、効率が悪くても確実性の高い方法に移行した方が良さそうですね。 ありがとうございます、まずPITIhを勉強をしてチャレンジしてみます。 一つそれに関連してお聞きしても良いでしょうか？ PITIh法やHITI法ではpX458などとともにプロモーターレスの鋳型DNAプラスミドを一緒に遺伝子導入しますが、その際の比率というのはどのくらいのレンジで振られていますでしょうか？ たとえば（本来はモル比で比較すべきでしょうが）pX458を3マイクログラムに対し、鋳型プラスミドはその何倍くらいを加えれば良いでしょうか？もちろん条件検討は必要ですので、おおよそ0.1倍から10倍くらいまでのレンジで振って効率をみるべきでしょうか？ 質問ばかりで誠に恐縮しておりますが、印象を聞かせていただけると幸いです。 ドナーのデザインは、23からなるエクソン（23番目にストップコドンがあります）のうち、22エクソン内のgRNA配列を選択しました。鋳型には22エクソンのgRNA配列以降+エクソン23+タグを持たせています。 鋳型プラスミドはpUC57を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.7903-4 - 2019/05/20 (月) 13:05:58 - AA 株化されている培養細胞であれば、MMEJが一番効率が良いと思います。 広島大学から報告が出ているので参考になると思います。 あるいは阪大からnickaseを使う方法も出ています。 培養細胞であればこのあたりが誰がやってもうまく行っている印象です。 ただ、基本的に培養細胞でノックインする場合は効率は良くて1%くらいだと思ったほうがいいです。 何らかの形で濃縮をかけない限りノックインは取れない、というのが私の印象です。 なお、ドナーのデザインは大丈夫でしょうか？ C末端にいれたいということですが、 DSBの起こる位置にダイレクトに変異が入らないと効率はガタ落ちします。 わかりにくい例えですが、 N-あいうえお-C-おまけ、 としたいなら、 必ず、"お"よりも後ろで切れるガイドを選択する (STOPコドンはドナー中で改変してread throughにしておく) というのが大事です。 ただし場所優先で切断活性が低いガイドを選ぶとうまくいかないので ガイドの選択が非常に重要になります。 ちなみにSCR7は実はあんまり効かないのではと思っています。 経験上、vivoもvitroも効率がまともに上がった試しがありません。

(無題) 削除/引用 No.7903-3 - 2019/05/20 (月) 12:44:17 - ノッキン AA様 書き込み、ありがとうございます。 > 対象としているものは何でしょうか？ > (HITIということはin vivoで非増殖の細胞でしょうか) いえ、in vivoでの非増殖細胞ではなく、一般的なヒトの癌のセルラインで行おうとしています。 今回、ある遺伝子のC末に200塩基ほどのタグを含む配列を挿入したいです。 一年ほど前にpiggybac transposonを用いたHDRを同セルラインで試してもいましたが、SCR7（NHEJ阻害剤）を使ったりもしましたが、工程が長く、あまり成功例がなかったため途中で断念し、HITIの高効率に惹かれこの4ヶ月ほど取り組んで来ました。 ssODNを用いる方法は以前としてかなり効率は低いと予想しています。 なのでHITIがvitroでうまくいけばと願って始めたのですが、全くうまくいっていません・・・ 癌のセルラインで200塩基ほどの配列をC末に挿入する効率の良い方法をご紹介していただけると大変助かります。どうか、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.7903-2 - 2019/05/20 (月) 12:20:40 - AA 対象としているものは何でしょうか？ (HITIということはin vivoで非増殖の細胞でしょうか) 何に入れたいかによって取れる手段も変わると思います

CRISPR-Cas9を使ったノックイン方法でおすすめ 削除/引用 No.7903-1 - 2019/05/20 (月) 07:39:57 - ノッキン CRISPR-Cas9を使ったノックイン方法でおすすめのものを教えていただけませんでしょうか？ 私は興味ある遺伝子のC末にタグを挿入したいです。 これまで約4ヶ月ほどかけてHITI法を試しましたが、全てのデザインにおいて論文（2016年発表）にあるようなノックインは確認できず、成功経験はゼロです。 デザインはダブルチェックを行っており、うまくいくはずなのですが。。 gRNA/Cas9によるDSB効果は高いことは確認しています。 もはや手も足も出ずというところです。 昨日セミナーでCRISPRでノックインを行ったデータを発表されてる方がいました。 どの方法を用いたかはわかりませんが、HITI法以外のもので何かあれば...と考えています。 Piggybacトランスポゾンを用いる系もありますが工程が多いためできれば避けたいです。 よろしくお願いいたします。

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