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(無題) 削除/引用 No.7977-23 - 2019/06/14 (金) 07:01:01 - ぇcrvty 小さい／細かい泡は、あってもほとんどまったく結果には影響ありません。電気もちゃんとながれます。取ってもいいですが気分的なもんだいです。てか嫌ならゲル板／装置を傾ければ横から出て行きます。 （ガラスとゲルの間に空気がはいることもごくたまにありますが、あれも意外に影響なかったです）。 誰が見てもこれやばいだろというような巨大な気泡があるとかだと影響するかもしれないですが、普通はあまりそんな気泡ははいりません。

返答ありがとうございました 削除/引用 No.7977-22 - 2019/06/14 (金) 03:56:56 - Mont 皆様、返答いただきましてありがとうございました。 お陰様で、胸のモヤモヤが晴れてスッキリした気分です。 思っていたより、「泡を取り除かない派」の方が多くて少しびっくりしました。 ついでに、自分が思っていたより泡の影響は少ないらしい、という結論に至りました。もっとグニャグニャになるのかと思っていましたが、ほぼ許容範囲内かなと。 そして「泡を取り除く派」の方も少数ながらいらっしゃったので、安心しました。 今後は自信を持って（無駄ではないと信じて）、「神経質にならずサラッと泡取りする」ことにします。綺麗なバンドが出ると、結構快感なので（笑。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7977-21 - 2019/06/14 (金) 00:24:29 - おお 最初教えてもらったときはそういうふうにしてた（１５cmの大きいゲルでした）。バイオラッドのミニゲルでゲルを作るようになってからは見てもいません。 完全に全体をブロックしそうな大きな気泡だったらともかく細かいものはあまり気にしなくてもいいという意見はまあそうだなと思います。気泡がなくとも底の方はゲルのできも均一でなかったりすることもあるので底での乱れはそういう場合は解消されないかもしれない。そういう場合でもやはり底以外はちゃんと流れているし、経験上は。

(無題) 削除/引用 No.7977-20 - 2019/06/13 (木) 19:22:10 - み 参考になるサイトがあったから貼っつけとく。 10ページ目のトラブルシューティング https://www.cosmobio.co.jp/upfiles/catalog/pdf/catalog_11973.pdf 写真つきで解説されてるけど、これと同じ器具を使用していて普通にでかい泡が入るのね。 http://ruo.mbl.co.jp/bio/support/method/sds-page.html

(無題) 削除/引用 No.7977-19 - 2019/06/13 (木) 18:49:53 - AP >ＡＰさん御丁寧に御指摘ありがとうです。 なんか未だに泡の位置がお互いで異なっていると思います。 ゲルの下端（内部）ではなく、ゲルの下のbufferの部分で溜まる泡です。 だからわかってますって。 ゲル内部にできる空胞を例に出したのは、現象としては同じことだからです。そのほうが電気的にどういうことが起こるのかというのが理解しやすいだろうと思うからです。 つまり幅のある導電体（ゲル、バッファー）に電圧をかけたとき、導電体が（空胞で）途切れたとき電圧がとうかかり電流がどう流れるかです。 空胞があるために電圧が偏ってかかり電流が偏って流れますが、空胞をすぎれば電圧は勾配に従って偏りを解消する方に動くので、意外と乱れませんよ、ってこと。ましてや細かい泡が少々入ったくらいじゃ、電流の乱れは泡の直径程度の範囲でしょう。プラクティカルに問題にならないので気にしない人がいてもおかしくない。でも気にする方を笑うつもりもない、そういうこと。

(無題) 削除/引用 No.7977-17 - 2019/06/13 (木) 17:56:07 - み >[Re:15] APさんは書きました : > はい、その方に理解していました。 > ゲル下端で電流が迂回したとしてその周囲でパターンが乱れたとしても、通常、そこは泳動のフロントラインにあたり、セパレーションが期待できない領域ですので、標的がそのへんに来るような泳動はしないだろうということです。 > > > 「でっかい泡」を入れてみて初めて認知できるような乱れだといっているのにそれは「少なからずじゃない」とわざわざ異議をとなえることかなあ、なんか矛盾してるんじゃないかなあと思ったのです。 ＡＰさん御丁寧に御指摘ありがとうです。 なんか未だに泡の位置がお互いで異なっていると思います。 ゲルの下端（内部）ではなく、ゲルの下のbufferの部分で溜まる泡です。 泡が溜まっている部分に相当するレーンが流れなくて湾曲したことないですか？全レーンが一直線に流れず乱れるから、論文用のデータには見映えが悪い。 標的蛋白をそんな下端で検出しないだろうとかそういう問題ではなくてです。 自分のなかでは矛盾はしてなくて、小さな気泡だったら殆ど見えないくらいの影響だし、皆さん気付いてなくて除去する必要ないと思っているだろうけど、大きい気泡の時に乱れるのだから、程度に差はあれ小さい時にも乱れているでしょうというスタンスで、自分は毎回先を曲げたシリンジで除去してます。１０秒も掛からない手間なので笑。 まあ除去しなくても問題なく行えている人はそれで継続されたら良いですが。

(無題) 削除/引用 No.7977-16 - 2019/06/13 (木) 17:20:38 - AP >ゲルとゲル板の間ではなく、 もちろんそういうことを言ったのではありません。 スペーサーが0.5 mmとかの薄いゲルをつくるとアクリルアミドの気泡がそのままゲル板に挟まって空胞のままゲルが固まってしまうのね。そういうゲルでシークエンスすると空胞の周囲では迂回して流れてバンドが乱れるけれど、しばらく通り過ぎるとほかのところと見分けがつかない程度に回復するの。 どれくらいで回復するかというと、小さなアブクだとちょっとの距離通り過ぎれば回復するけど、アブクが大きければ大きいほど長い距離が必要になってくるの。そう、シークエンスって50 cmとかの長いゲル使うので、アブクからだいぶ距離が離れるまでラダーが追えるものですから。 ま、言いたいのは、トピ主さんが話題にしているような小さなアブクと、1-2 cmの大きなアブクは影響が波及する範囲が違いますから同一視はできませんってこと。

(無題) 削除/引用 No.7977-15 - 2019/06/13 (木) 17:05:07 - AP >APさんの前のコメントを読んだ時、「検出する部分はそんなに下端ではないだろうから」とかコメントされてましたが、泡の位置を誤解されている気がしました。 ゲルとゲル板の間ではなく、質問はゲルを立てかけた時にゲルの下に蓄積する泡ですよね。手製のゲルの場合、これは結構大きな泡が入ることはある。 はい、その方に理解していました。 ゲル下端で電流が迂回したとしてその周囲でパターンが乱れたとしても、通常、そこは泳動のフロントラインにあたり、セパレーションが期待できない領域ですので、標的がそのへんに来るような泳動はしないだろうということです。 「でっかい泡」を入れてみて初めて認知できるような乱れだといっているのにそれは「少なからずじゃない」とわざわざ異議をとなえることかなあ、なんか矛盾してるんじゃないかなあと思ったのです。

(無題) 削除/引用 No.7977-14 - 2019/06/13 (木) 16:51:04 - み >[Re:13] APさんは書きました : > >少なからずじゃないよ。 > >直径１，２cmのでっかい泡を入れてみればわかる。 > > そんな「でっかい」気泡をいれりゃ「少なからず」じゃすまないでしょうね。 > それだけの気泡を残したままゲルをセットするというのはかえって難しそうだし、いくらなんでもそれだけのアブクを気づかず、あるいは気にせず実行してしまうのはかなりの大者なんじゃないか？ 念のため。。。 まあ言いたいことは小さな泡でも気付かない程度でも同様のことが起こっていると容易に想像できるでしょうということ。 APさんの前のコメントを読んだ時、「検出する部分はそんなに下端ではないだろうから」とかコメントされてましたが、泡の位置を誤解されている気がしました。 ゲルとゲル板の間ではなく、質問はゲルを立てかけた時にゲルの下に蓄積する泡ですよね。手製のゲルの場合、これは結構大きな泡が入ることはある。 泡がある部分は泳動されず、逆Ｕ字型に湾曲して流れる。 この点はＡＰさんも電流が迂回して云々カンヌンと解説されていたから認識が一致していますが。

(無題) 削除/引用 No.7977-13 - 2019/06/13 (木) 16:34:21 - AP >少なからずじゃないよ。 >直径１，２cmのでっかい泡を入れてみればわかる。 そんな「でっかい」気泡をいれりゃ「少なからず」じゃすまないでしょうね。 それだけの気泡を残したままゲルをセットするというのはかえって難しそうだし、いくらなんでもそれだけのアブクを気づかず、あるいは気にせず実行してしまうのはかなりの大者なんじゃないか？

(無題) 削除/引用 No.7977-12 - 2019/06/13 (木) 15:16:39 - み 少なからずじゃないよ。 直径１，２cmのでっかい泡を入れてみればわかる。 もちろん小さな泡が寄り集まってる程度ならその泡と泡の間を電流が通るから影響がないように見えるけどね。

(無題) 削除/引用 No.7977-11 - 2019/06/13 (木) 14:40:45 - あいみょん ウェルの洗いはピペットマンでちまちまやると時間が微妙にかかるから 自分は、コームを抜いたらすぐ洗瓶に入った純水でウェルを良く洗うようにしているなぁ。それで、ウェルが汚くなったことはあまりない。たまーにあるくらい。

少なからず影響しているような、、、 削除/引用 No.7977-10 - 2019/06/13 (木) 13:15:24 - Mont 回答頂いた皆様、ご意見ありがとうございます。 ネットでこんな動画を見つけたので、気になる方はご覧ください。 https://m.youtube.com/watch?v=MNJrCVc4Qz4 これを見る限り、ゲル下端の泡が泳動パターンに少なからず影響しているような気がします。クリティカルな影響じゃない(たぶんほんのちょっとバンドが歪む程度で、導き出される結果は同じ)、でも少しでもベストな状態で臨みたいなら、やっぱり泡は除いたほうがいいのかなーと思っています。 歪みのない綺麗なウェスタンのFigureは、reviewerの心象も良くなりますよね。泡を取り除く時間は1分もかからないし、少しでも綺麗な結果を得られるなら、これまで通り泡を取り除いて泳動することにしようかなと思っています。 ちなみに、私はウェルを洗って(Running buffer, 1mlピペットで数回洗浄)から、サンプルをアプライする派です。

(無題) 削除/引用 No.7977-9 - 2019/06/13 (木) 12:28:03 - み でっかい泡をわざと入れて流してみ。 その流れ方を同僚に見せてやれ。

(無題) 削除/引用 No.7977-8 - 2019/06/13 (木) 11:30:51 - 774 Montさんと同じく、シリンジと曲げた針で取り除いていました。 理屈はAPさんやあいみょんさんの仰っている通り。 うちでは泳動前と、泳動中も大きな泡が溜まったら(細かい均一な泡なら気にしない)取り除いていました。

(無題) 削除/引用 No.7977-7 - 2019/06/13 (木) 11:29:28 - 雀 シリコンチューブなどでシールするタイプはゲル板の下端にゲルのないスペースができるので空気を抜いていましたが、プレキャストでゲル板ギリギリまでゲルが詰まっているタイプはセットする時にちょっと気をつけるだけ、それで残るような1mm以下の泡は気にしていませんでした。

(無題) 削除/引用 No.7977-6 - 2019/06/13 (木) 11:28:26 - gon 昔は泡を丁寧にとってたけど、今はしてません。 あいみょんさんと同じで泳動槽を傾けて簡単に取れるものはとる、 くらいです。 やり方を変更してからWBがうまくいかなくなった、なんてことはないです。 理論上泡わない方がよいのでしょうが、実際はあんまり関係ない気がする。

(無題) 削除/引用 No.7977-5 - 2019/06/13 (木) 11:12:34 - あいみょん 泡は確実に取る派。 泡があるレーンで、泳動ムラがでてしまうから。 ただ、確認程度のSDSPAGEならあんまり気にしないけど、 論文見据えてのデータだったら絶対取りますね。 泡の取り方は、泳動Bufferがこぼれてもいいから、泳動槽ごと傾けてあわを抜くことかな。

(無題) 削除/引用 No.7977-4 - 2019/06/13 (木) 10:52:50 - こいけ 無理には取り除かない派です。セットしたときにトントンしたり斜めにして大まかな泡は取りますが、「シリンジを使ってきれいに取り除いて」といったことはしません。特に泳導に問題があったことはないですね。

(無題) 削除/引用 No.7977-3 - 2019/06/13 (木) 10:50:29 - AP 理屈から言えば泡を取り除いたほうがいいでしょう。 電流が泡を迂回して流れるので、その周辺ではパターンが乱れるでしょう。 しかし、ゲルの下端に見たいバンドはないのでほうっておいても実害はなさそうです。 ゲルの上端や、ゲルの中に空胞（昔、自作スラブゲルでシークエンスをやっていたときはありがちだった）があっても、その周辺ではパターンは乱れるけれど、それをす過ぎると不思議とパターンは元通りになっていたものです。 局所的に電流が乱れても、電流電圧の偏りは自ずと解消されるからでしょう。

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