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(無題) 削除/引用 No.8023-22 - 2019/06/26 (水) 23:34:29 - qPCR ＞実はqPCRなんてくらいな軽い気持ちで雑にサッサとやった1回目が一番うまく行っているのです こういうことをいう方って、プライマーが妥当かどうかのチェックや、自分のqPCRがきちんとワークしているものかどうかのチェック（単純に言えば、cDNAを二倍量入れたらCtが１減り、半分量でCtが１増えるかどうか）をきちんとやっているんでしょうか……。失礼ながら、やっているようには見えないです。「ただ試薬を混ぜて機械にかけて、出てきたCtの値を見てる（鵜呑みにしている）」だけだったりしませんか……

(無題) 削除/引用 No.8023-21 - 2019/06/26 (水) 18:09:59 - SYBR master >[Re:18] Qさんは書きました : > 横ですがたいへん参考になりました。 Ｑさんのトピックにも少し追加しておきました。ご参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.8023-20 - 2019/06/26 (水) 18:06:57 - SYBR master >[Re:19] qPCRの一部結果がでないさんは書きました : > SYBRを先に入れるのは光遮断の関係で若干不安もありますが（恐らく大丈夫かとは思いますが） 一般的な白熱電球および蛍光灯なら、SYBR Green Iの吸収波長λ=488 nmは、発光強度が小さいので、何ら問題が無いです。ただ、白色LEDの場合、メーカーによって発光強度が強いものもあるので、確認してください。市販されている白色LEDは、Blue-LEDの光の一部を蛍光体で変換して黄色を含ませているものが多いので、Blue-LEDの波長がλ=488 nmに近いものもあります。

(無題) 削除/引用 No.8023-19 - 2019/06/26 (水) 11:21:07 - qPCRの一部結果がでない SYBR masterさん ありがとうございます。 非常にしっくりきました。 実はqPCRなんてくらいな軽い気持ちで雑にサッサとやった1回目が一番うまく行っているのです。 SYBRを先に入れるのは光遮断の関係で若干不安もありますが（恐らく大丈夫かとは思いますが）、その手順で行きたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8023-18 - 2019/06/26 (水) 10:58:05 - Q No.8023-17 SYBR master さん 横ですがたいへん参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.8023-17 - 2019/06/26 (水) 10:36:10 - SYBR master 取りあえず、いろいろ脳内で補完して考えるに、入れる順番を SYBR→sample (cDNA)→遠心にしてみたら 最初の質問が文字化けしているけど、たぶん、反応10マイクロですよね？だとするとsample (cDNA)の分中量は１か2マイクロだと予想しますが、その場合SYBR入れる前に乾いたか、静電気でどっかに飛んでいる能性があります。アメリカ、場所にもよるだろうけど、基本日本より湿度低いと思うので、ちんたら分注してたら直ぐ乾くし、ニトリルグラブはめた状態でのPCRプレート触ると、簡単に帯電しますよ。ラテックスだと、少し帯電しにくいけど。 先にSYBR mix (8か9マイクロ）を分注して、そこにsampe(cDNA)加えていけば、ぶれないと思います。

(無題) 削除/引用 No.8023-16 - 2019/06/26 (水) 09:04:32 - あかね 泡があっても増幅はしそうですね笑 ただそこに定量性があるかは私はやや懐疑的です。

(無題) 削除/引用 No.8023-15 - 2019/06/26 (水) 04:22:22 - qPCRの一部結果がでない お二方、本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8023-14 - 2019/06/26 (水) 04:07:53 - こいけ 自分の経験ですが、泡はぶくぶくの状態ではやったことがありませんが、一つぷっくりあった状態でもきれいに増幅していました。

(無題) 削除/引用 No.8023-13 - 2019/06/26 (水) 04:06:34 - あかね > qPCRの機器に入れる前に泡だったプレートが多くあったのは気になっておりました。 それは原因になり得そうです。 高熱により最終産物では泡は消えてそうですけど。 最終産物を泳動したことはありますか？

(無題) 削除/引用 No.8023-12 - 2019/06/26 (水) 04:05:20 - こいけ 単純に手技の問題じゃないでしょうか？よそラボの機械を借りてqPCRをやっていますが、そのラボの学生さんが同じように結果が出ないので機械の不具合を疑ってこちらの結果を聞きに来ましたが、こちらはきれいな結果がでていたので機器の問題ではないと指摘したことがあります。 遠心はサイバーとサンプルをすべていれて、機械にかける直前にかけます。するとすべてのサンプル/サイバーの液体がチューブの側面でなくボトムにある状態でqPCRかけられますよね。（たぶんそうやられていると思います。） 次回はもう少し時間をかけて、ゆっくり丁寧に確認しながらやってみるとどうでしょう。案外真ん中のほうにいくと入れ忘れもありえるかもしれませんし。サイバーは入れたけどサンプル入れ忘れた、とか。

(無題) 削除/引用 No.8023-11 - 2019/06/26 (水) 03:50:22 - qPCRの一部結果がでない ありがとうございます。 サンプル→SYBRグリーン→遠心は一度行いました。 サンプル→遠心→SYBRグリーンということでしょうか？ いずれにしても泡を消すということですね？ qPCRの機器に入れる前に泡だったプレートが多くあったのは気になっておりました。

(無題) 削除/引用 No.8023-10 - 2019/06/26 (水) 03:17:20 - あかね よくあるミスとして、分注した際に液がウェルのそこに行き届かず、気泡の上に液が乗っかるってる。 サンプルを分注してDNAを入れたら一度遠心してみてください。

(無題) 削除/引用 No.8023-9 - 2019/06/26 (水) 03:04:58 - qPCRの一部結果がでない はい、増えないということです。

(無題) 削除/引用 No.8023-8 - 2019/06/25 (火) 23:59:33 - おお 結果が出ないって具体的にはどういうことですか？全く増えないってことですか？ ピペッティングでうまく吸えてないところがあるってこと？

(無題) 削除/引用 No.8023-7 - 2019/06/25 (火) 21:54:49 - qPCRの一部結果がでない ありがとうございます。 アメリカにラボが変わったばかりで若干苦戦を強いられております。 やはり手ですね。前ラボとの違いを改めて考えます。 マスターミックスは、各プライマー毎（１２本×30well分）に作り、その後wellに投入しております。

(無題) 削除/引用 No.8023-6 - 2019/06/25 (火) 14:26:28 - AP そうなってくると、「手」の問題としか言えないな。 つまりハンドリングのエラーやブレ。 こればっかりは傍らで見ていないとわからないけれど、 反応の組み方、手順を説明してもらえれば、なにかアドバイスはあるかも。 SYBR masterさんの質問の意図を噛み砕くと、マスターミックスをサンプルに分注するという手順になってますよね（もちろん）？　ってことです。

(無題) 削除/引用 No.8023-5 - 2019/06/25 (火) 14:07:13 - SYBR master >[Re:4] qPCRの一部結果がでないさんは書きました : > WellにサンプルやSYBグリーンを投入する時の操作を疑っております。 まさかと思うけど、毎度reaction mixtureを、各ウェルで作成しているの？

(無題) 削除/引用 No.8023-4 - 2019/06/25 (火) 11:23:56 - qPCRの一部結果がでない はい、サンプルはそれぞれ独立しており、Duplicateです。 Duplicateのうち半分は結果が出ることが多いです。 毎回同じサンプルを同じwellbに入れておりますが、結果が出るwellと出ないwellが異なります。なお、数回測定して、結果が出ているものの数値は非常に似通っております。 WellにサンプルやSYBグリーンを投入する時の操作を疑っております。

(無題) 削除/引用 No.8023-3 - 2019/06/25 (火) 11:14:12 - AP サンプルはそれぞれ独立したものか、replicateか？

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