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(無題) 削除/引用 No.803-21 - 2012/08/02 (木) 21:50:58 - vec > 37度で震盪培養（2 ml）し、その大部分をPI-50のプラスミド精製機にかけ、震盪培養していた試験管に再度新しいLB/Ampを2 ml加え、12 hrs後試験管を見ると これって、本来別のベクターを用いても成立するやり方ですか？ PI-50にかけて、プラスミドを取った菌体の残滓からもう一度大腸菌を増やそうとしているんですよね？ PI-50にかけると、大腸菌はさすがに死んでると思うのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.803-20 - 2012/08/02 (木) 20:46:22 - Harmonia > 37度で震盪培養（2 ml）し、その大部分をPI-50のプラスミド精製機にかけ、震盪培養していた試験管に再度新しいLB/Ampを2 ml加え、12 hrs後試験管を見ると それは何のための操作でしょう？ 最初から4 ml培養ではない理由です。

(無題) 削除/引用 No.803-19 - 2012/08/02 (木) 10:32:23 - momo うさん 774さん おはようございます。 そうなんですか！これまでpMXs系のレトロウイルスベクターは問題なくcloning, 大腸菌培養, plasmid精製が出来ていました。 実は今回もう一つ問題が出てきました。その答えを今まさにいただいたようです。 実はレトロウイルスベクターにinsertをligationし、それをDH5αに形質転換後、コロニーをピックアップし、37度で震盪培養（2 ml）し、その大部分をPI-50のプラスミド精製機にかけ、震盪培養していた試験管に再度新しいLB/Ampを2 ml加え、12 hrs後試験管を見ると12hrs前には増えていた大腸菌が、全く増えていないことがここ２日連続で起きました。 deletionや何らかの原因なのかなと思うようになりました。 ぜひ30°Cにして震盪培養してみます。

(無題) 削除/引用 No.803-18 - 2012/08/02 (木) 09:35:47 - う ウイルスベクターということで、私がやっていることをひとつ。 他の方もご指摘の通り、deletionされやすいです。 これはシングルコロニーうんぬんの問題でなく、 プラスミド調整前の大腸菌の培養時に起こっているようです。 私の経験では、適しているという大腸菌株においても、です。 よくウイルスベクターを使っている方々の話と私の経験からいうと、 大腸菌が早く増殖するとよくないみたいで、30℃とおっしゃられる方もいらっしゃいましたが、 私の場合、もうすこし飛躍して、室温であったり、もしくは 震盪しないで静置ということも行なったりします。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.803-17 - 2012/08/02 (木) 08:08:13 - 774 レンチ・レトロウイルスベクターは２つLTRを持つので、deletionが起こりやすいので、 DH5aよりもdeletionが起こりにくいStbl2などがbetterです。 mini-prepしてクローンをいくつか拾ってみると、まあまあの割合でdeletionしてる印象があります。 （DH5aでは特に。） なので、prep後は制限酵素処理してdeletionが起こってないことを確認した方が無難です。

(無題) 削除/引用 No.803-16 - 2012/08/01 (水) 23:19:58 - momo Harmoniaさん もっともなご指摘ありがとうございます。 >[Re:12] Harmoniaさんは書きました : > 申し訳ないけど、この写真では議論できません。 > アプライ量が違いすぎます。 > 反応に投入したDNA量が同じになるように各レーンに泳動して、このような > 絵になるのでしょうか？ bandが複数出るとはこの時は想像もしなかったため、サンプルの一部を取ってbandが確認できればいい、と思ってしまった結果です。これを反省点として今後は当たり前のことですが、load量を統一します。 > また、揚げ足取りではないですが、レーン３の「続いて」って、 > どういう意味でしょうか？ > レーン１で使ったサンプルに酵素１を入れると量が減って（レーン2）、 > さらに酵素２を入れるとDNA量が増える（レーン3）？ 続いてとはsequentialにdigestしたという意味です。わかりずらくて大変恐縮です。 > それと、「PCR画像を」っていうのは書き間違いですよね？ > 間違いでないなら、「PCR画像」が何であるのかを説明してください。 私の間違いです。制限酵素で処理したサンプル画像とすべきでした。 申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.803-15 - 2012/08/01 (水) 23:14:44 - momo APさん コメントありがとうございます。 >[Re:10] APさんは書きました : > この写真は、最初に書いてあった問題とは別件でしょうか（1-cutでリニア一本になるはずが、マイナーバンドが見えるという）。 すみません、、別件です。大変申し訳ありません。 ただ、現象は同じでuniqueな制限酵素で切断すると複数個ものbandが見られます。 > ウィルスベクターの方の泳動像で、2-cutのバンドが > メインのバンド　6 kb + 1 kb = 7 kb > マイナーのバンド　4 kb + 3 kb = 7 kb > のように見えます（サイズは目分量です）。 このご指摘をいただいてドキっとしました。 ただ、下記のコメントがすみません、理解できません。 とても重要なことのように思えてなりません。どうか1 kbのインサートが逆向きに入ると、なぜ4 kbと3 kbのbandが出現してしまうのでしょうか？ > これって、たとえば、３kb ベクターに4 kbインサートで、クローニングサイトで一箇所、インサートの端から1 kbのところで一箇所切ったとして、インサートが逆向きのクローンがコンタミしているケースにさも似たりではないでしょうか。 コロニーを早速pickし直しました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.803-14 - 2012/08/01 (水) 23:07:09 - momo 774さん コメントありがとうございます。 >[Re:9] 774さんは書きました : > 2cutを違う酵素の組み合わせでやったらどうなりますかね？ > 酵素のコンタミorスター活性の可能性は否定できそうな気がしますけど。 それは一理ありますね。明日、行ってみて、酵素系にコンタミ／スター活性なのか判断してみます。

(無題) 削除/引用 No.803-13 - 2012/08/01 (水) 23:05:35 - momo ~さん コメントありがとうございます。 >[Re:8] ~さんは書きました : > Deletionしやすいベクターの一つがウイルスベクターでして、 > それでlane 3の説明はつけられるかもしれません。 > > また、DH5αでウイルスベクターを増やすのであれば、30℃で培養すると、37℃で培養するよりもデリーションが抑えられます。 > （それでもデリーションが見られたため、私はStblシリーズを使っていました） ウイルスベクターの増幅にとってDH5αはホストとして適当ではないのですか！？温度を下げて培養はとても参考になりました。次回それで行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.803-12 - 2012/08/01 (水) 21:46:20 - Harmonia 申し訳ないけど、この写真では議論できません。 アプライ量が違いすぎます。 また、揚げ足取りではないですが、レーン３の「続いて」って、 どういう意味でしょうか？ レーン１で使ったサンプルに酵素１を入れると量が減って（レーン2）、 さらに酵素２を入れるとDNA量が増える（レーン3）？ 反応に投入したDNA量が同じになるように各レーンに泳動して、このような 絵になるのでしょうか？ それと、「PCR画像を」っていうのは書き間違いですよね？ 間違いでないなら、「PCR画像」が何であるのかを説明してください。

(無題) 削除/引用 No.803-11 - 2012/08/01 (水) 14:46:02 - AP ああ、single colonyを単離しても変わらないと書いてありましたね。 lane 6のサブバンドは見えないのですが、そのへんだと、切残りの部分変成cccだといっても矛盾ないです(変成していないcccよりわずかに移動度が大きい)。

(無題) 削除/引用 No.803-10 - 2012/08/01 (水) 12:31:09 - AP この写真は、最初に書いてあった問題とは別件でしょうか（1-cutでリニア一本になるはずが、マイナーバンドが見えるという）。 市販品でコンタミ！なんてことはないと信じたいですが、 ウィルスベクターの方の泳動像で、2-cutのバンドが メインのバンド　6 kb + 1 kb = 7 kb マイナーのバンド　4 kb + 3 kb = 7 kb のように見えます（サイズは目分量です）。 これって、たとえば、３kb ベクターに4 kbインサートで、クローニングサイトで一箇所、インサートの端から1 kbのところで一箇所切ったとして、インサートが逆向きのクローンがコンタミしているケースにさも似たりではないでしょうか。 念のため、一旦トランスフォーメーションして、シングルコロニーを拾い直しては。

(無題) 削除/引用 No.803-9 - 2012/08/01 (水) 10:57:02 - 774 2cutを違う酵素の組み合わせでやったらどうなりますかね？ 酵素のコンタミorスター活性の可能性は否定できそうな気がしますけど。

Lane 3について 削除/引用 No.803-8 - 2012/08/01 (水) 10:53:14 - ~ Deletionしやすいベクターの一つがウイルスベクターでして、 それでlane 3の説明はつけられるかもしれません。 また、DH5αでウイルスベクターを増やすのであれば、30℃で培養すると、37℃で培養するよりもデリーションが抑えられます。 （それでもデリーションが見られたため、私はStblシリーズを使っていました）

(無題) 削除/引用 No.803-7 - 2012/08/01 (水) 09:59:53 - momo みなさま コメントありがとうございます。 http://www.fastpic.jp/images.php?file=0859543235.png 上記アドレスにPCR画像をuploadいたしました。 ・インサート入り市販のウイルスベクター lane 1: uncut lane 2: uniqueな制限酵素１でcut lane 3: 続いてuniqueな制限酵素２でcut ・インサート入りTA vector lane 4: uncut lane 5: uniqueな制限酵素１でcut lane 6: 続いてuniqueな制限酵素２でcut lane 1と4では環状プラスミドの超高次構造（cccなど）が見られます。 lane 2と5ではマジックで右に点を付けた位置に（apply量が少ないですが）一つbandが見られます。これは環状プラスミドがリニア化したものと思います。 lane 3と6が問題でして、特にlane 3をご覧になっておわかりだと思いますが、vectorのbackboneである5.8 kbとインサート1.4 kbの他に、うっすらと2.5 kbと4 kbあたりにbandが現れます。 うさん シングルコロニーを拾い直しても同じ結果です。 Harmoniaさん 大腸菌はDH5alphaを使用していますが、これを使うことには問題はありません。 ~さん deletionですが、、確かにそれは充分考えられますね。 私はそれほど遺伝子の切り貼りをしてきたわけではないので、プラスミド抽出が下手だったかもしれません。 今回は物が取れたのでよかったですが、次回、充分気を付けて抽出したいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.803-6 - 2012/08/01 (水) 09:18:01 - ~ ラボで増やしなおしたベクターであれば、デリーションが起きているとも考えられるのでは。 ベクターの種類によっては、菌株や培養温度によっては起きます。 また、デリーションしていないメインのバンドは元の配列ですので、目的のベクターが取れたという話にも矛盾しません。

(無題) 削除/引用 No.803-5 - 2012/08/01 (水) 08:35:07 - Harmonia 市販品をそのまま使っていてコンタミがあるとは考えにくいのですが。 （ないとは言い切れません） ラボで増やしなおしたものでしょうか？ また、ベクターとホストは何でしょうか？ ホストとベクターの組み合わせが間違っている ccdBを持つプラスミドをDH5αで増やしてしまったときなど（説明書にはDH5αは不適切と書かれているはず)、本来出るはずの無いエスケーバーがでます。 概してエスケーパーは本来のサイズで無いモノも出るので、予期しないバンドが見えることもあります。

(無題) 削除/引用 No.803-4 - 2012/08/01 (水) 01:31:35 - う 高濃度のグリせロールはスター活性を引き起こす。 何かのコンタミ。 (制限酵素のコンタミ、バッファーに何かがコンタミ、 精製したはずのプラスミドにコンタミ、使っている水などにコンタミ) Uncutも同じように３７度でインキュベートしてみるとか。 いつしか、プラスミドにコンタミ。 チューブの表示と実は違うプラスミドと入れ違っていた。 もしくは、ちょっとだけ違うのが混ざっているとか。 研究室にはいろんな人がいると思います。 新人なんかが何をやらかしたか、わかりませんし、 誰だってミスします。 まずは、そんなのあるはずないと思うことでも、 可能性を潰すことからやることも重要かと。 考えるだけではコンタミは見抜けません。

(無題) 削除/引用 No.803-3 - 2012/08/01 (水) 00:22:48 - momo APさま いつも勉強させていただいています。 CCC (covalently closed circular)ですとuncutでも出るはずですよね。 ですが、uncutでは見られないbandの高さなのです。 他にも同じような経験がありました。 例えば、5.8 kbのベクターに1.4 kbのインサートが入っているものから、インサートを切り出すと、1.4 kbと5.8 kbの高さに予想通り強いbandが認められるのですが、その中間の2.5 kbや4 kbに２本うっすらとしたシャープなbandが出ます。 こちらでもuncutでは出てこないようなbandです。 インサートを切り出して1.4 kbと5.8 kbが出るならいいかとは思いますが。。なんなんでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.803-2 - 2012/07/31 (火) 23:06:40 - AP linear 5.6 kbに対して4 kb付近のバンドというと未消化cccがその辺に来ると思いますが、制限酵素処理していないベクターを泳動した像と比べてみてどうでしょうか。 プラスミド精製でalkali lysisの工程を含むと、cccが部分変性し（イメージとしてはどこか一部分だけ一本鎖に解離）、そうなるとプラスミド全体の二本鎖対合状態が歪んでしまい、制限酵素が効かなくなります。 多かれ少なかれ、精製したプラスミドにはどのような部分変性した分子が含まれますが、精製が下手くそだと（手際が悪くてアルカリ処理時間が長引くとか）その量は増えます。経験上、市販品でそんなに目立ったことはないのですが。 なお、おそらく生体内ではそのような歪みはtopoisomeraseなどで解消されるのでしょう、そういうプラスミドでも高い形質転換能があるようです。セルフライゲーションのコロニーがたくさん出るという時、実は部分変性しているため消化されていない環状プラスミドのしわざということがほとんどのようです。

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