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ウエスタンブロットの結果の解釈 トピック削除
No.8040-TOPIC - 2019/07/02 (火) 09:12:54 - topi
いつも勉強をさせていただいています。

特定のタンパク質を薬剤の濃度を変えて壊し、ウエスタンブロットにて当該タンパク質の発現量の変化を見ています。

その際、予想通り、濃度依存的にバンドは淡くなっていくのですが、一定の濃度を超えると下記の2点の現象が起こり、解釈に難渋しております。

@バンドが2本になる
Aバンドが再び濃くなる

似たようなご経験のある方がいらっしゃったら、ご意見をお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.8040-5 - 2019/07/03 (水) 18:45:56 - Nanasi
DTTを使うということは、ジスルフィド結合開裂による構造の不安定化(それに続く分解)かERストレスの影響でも見てるのでしょうか?
少し文献検索してみると、DTT濃度がある程度まではERストレスまーかへの影響が可逆だけどそれ以上だと不可逆になるとかあるみたいなので、そう言う影響とか或いは変性タンパクが一定量を超えるとaggregate を作って分解されにくくなるとかあるのかも。

(無題) 削除/引用
No.8040-4 - 2019/07/02 (火) 21:31:18 - ほ
薬物の作用点は必ずしも1つじゃないし(ていうか、複数ある方が普通と思う)、特に濃度が上がれば、比較的親和性の弱いターゲットにも作用するようになるし、その結果として低濃度の時とは違うことがおこってくきて、それでまた2次的に別のことも起きてくるかもしれないし、濃度あげるにつれて、まあ、なんでもありになってくる。詳しく書けないけど濃度あげるていくと逆のことが起きてくる分子は実際ある。

バンドが2本になるのはすごく重要な発見かもしれない。リン酸化などの翻訳後修飾も予想される。当該分子がリン酸化されるものならば、その分子のリン酸化フォームを認識する抗体で見てみるといい。抗体が市販されていなければ、IPで当該分子を精製したものについてpTyrとかpSer/Thr抗体(注:いい抗体少ないけど)でウェスタンしてもいい。IPしてLCーMS/MSで分析してもうまくすると翻訳後修飾が検出できる可能性ある。
分子量が大きいタンパク質でなければ、IPしてMALDI-TOFで2本のバンドのタンパク質それぞれの精密な分子量を測定し、両者が分子量的にどのくらいズレてるかで、予想される修飾や限定分解についての重要な情報を得ることもできる。

ありがとうございます 削除/引用
No.8040-3 - 2019/07/02 (火) 20:01:59 - topi
>おお 様

ご回答ありがとうございます。

なお、薬剤はDTTを用いています。

(無題) 削除/引用
No.8040-2 - 2019/07/02 (火) 11:03:49 - おお
そら薬剤によって解釈がかわるというか、しやすいものもあるし、一般的な推察くらいしかできないものもあるだろうし。

一般的な推察だと
バンドが2本になるのは、、、やっぱりいっぱいあるな。
修飾
Degradation
スプライシングアイソフォーム

太くなるのは
2次的なイベント
その薬剤が(未知かもしれないけど)違うものにも高濃度で作用するため
薬剤の毒性で生理的機能を失ってしまったため。
細胞の分化などにより細胞1つあたりのタンパク量が大きく変動したため。

場合によれば面白い発見につながるし、アーティファクトの可能性が高いとしてとして高濃度はとりあえず置いておくこともあるでしょう。

その薬剤が一般的に出回っているもので開示できるのならもう少しSpecificな情報が得られるかもしれません。

ウエスタンブロットの結果の解釈 削除/引用
No.8040-1 - 2019/07/02 (火) 09:12:54 - topi
いつも勉強をさせていただいています。

特定のタンパク質を薬剤の濃度を変えて壊し、ウエスタンブロットにて当該タンパク質の発現量の変化を見ています。

その際、予想通り、濃度依存的にバンドは淡くなっていくのですが、一定の濃度を超えると下記の2点の現象が起こり、解釈に難渋しております。

@バンドが2本になる
Aバンドが再び濃くなる

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