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qPCRのサイクル数 トピック削除
No.8130-TOPIC - 2019/08/03 (土) 00:26:09 - 脂肪の研究者
こんにちは

qPCRのサイクル数について質問させてください。

基本的にラボでは45サイクルでqPCRを行っているのですが、最近購入したプライマーのいくつかは、45サイクルではCT値が算出されず、５５サイクルにするとCT値を得ることができます。なお測定組織は脂肪組織です。

そこで最近では、55サイクルでのqPCRに切り替えていたのですが、ふと他の45サイクルで結果が得られるプライマーへの影響が頭に横切りました。
ハウスキーピングとして使っているGAPDHを見ると大差なさそうなのですが、すべてのプライマーで45と55の差を検討するのは骨が折れそうです。

45サイクルで結果が得られるプライマーを55サイクルで行った際の影響について教えていただけないでしょうか？
1) プラトーに達しているので影響はない(あるいは無視できる程度)
2) GAPDHに影響はないが、測定したいプライマーに影響が出るものもある。
3) GAPDH含めすべてのプライマーに影響が出る
　
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(無題) 削除/引用
No.8130-7 - 2019/08/03 (土) 04:42:21 - 脂肪の研究者
全てのプライマーというよりも特定のプライマーだけですので、
プライマーの問題かもしれませんね。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.8130-6 - 2019/08/03 (土) 04:32:43 - おお
うーん確かに立ち上がり前後のシグナルをプロットして計算するだろうから立ち上がってから何サイクルか回さないと計算しないだろうけど、、、そういう意味ではマニュアルなどを目を通して見るべきかと思いますが。

＞CT値は３８から４２程度

事情はわかりませんが、ノンスペを拾ってないならちょっと高すぎるのでプライマーの効率などが悪いような気がします。あるいはサンプル自身の問題か、、、

(無題) 削除/引用
No.8130-5 - 2019/08/03 (土) 03:44:06 - 脂肪の研究者
お二方ありがとうございます。

いいえ、CT値は３８から４２程度です。
それ以外は、おおよそ２０−３５程度で収まります。

＞45サイクルではCT値が算出されず、５５サイクルにするとCT値を得る

そのCT値は４５と５５の間ですか？それともそれより少ないですか？

(無題) 削除/引用
No.8130-4 - 2019/08/03 (土) 02:29:28 - おお
＞45サイクルではCT値が算出されず、５５サイクルにするとCT値を得る

そのCT値は４５と５５の間ですか？それともそれより少ないですか？

(無題) 削除/引用
No.8130-3 - 2019/08/03 (土) 02:28:05 - おお
CT値は蛍光シグナルが検出限界を超えるときのサイクル数、立ち上がってくるサイクル数のことだからその後どんだけサイクルを回しても関係ありません。

５５はちょっと回し過ぎと個人的には思います。機会があれば１コピーをPCRチューブに入れてPCRすると何サイクルでDNAが（qPCRの溶液中で）検出できるようになるか計算してみるといいでしょう。そうすると４５サイクルでも多すぎることがわかると思います。

プライマーの増幅効率は確認してますでしょうか？低いなら立ち上がりが遅くなるでしょうけど、

(無題) 削除/引用
No.8130-2 - 2019/08/03 (土) 01:55:49 - asan
45ででないとか、55で出るという意味があいまいですが、
多くの場合低発現のものでも30-40サイクルぐらいの範囲に入るし、それ以上回してもノイズピークを拾ってるだけだったりプライマーダイマーとか意味ない増幅であることがほとんどでは？ 試薬が何がわかりませんが、試薬に推奨サイクル数はあるのでそれ以上回しても試薬が枯渇したりとかで定量性がないかもしれません。

ま、ぶっちゃけ、ちゃんと希釈系列作ってそのサイクル数でちゃんと定量性がある範囲に乗れば文句はないでしょう。てか、なんサイクルだろうが、ちゃんとddCTとかやる前に定量性のあるCT値は調べとく必要があります。

qPCRのサイクル数 削除/引用
No.8130-1 - 2019/08/03 (土) 00:26:09 - 脂肪の研究者
こんにちは

qPCRのサイクル数について質問させてください。

基本的にラボでは45サイクルでqPCRを行っているのですが、最近購入したプライマーのいくつかは、45サイクルではCT値が算出されず、５５サイクルにするとCT値を得ることができます。なお測定組織は脂肪組織です。

そこで最近では、55サイクルでのqPCRに切り替えていたのですが、ふと他の45サイクルで結果が得られるプライマーへの影響が頭に横切りました。
ハウスキーピングとして使っているGAPDHを見ると大差なさそうなのですが、すべてのプライマーで45と55の差を検討するのは骨が折れそうです。

45サイクルで結果が得られるプライマーを55サイクルで行った際の影響について教えていただけないでしょうか？
1) プラトーに達しているので影響はない(あるいは無視できる程度)
2) GAPDHに影響はないが、測定したいプライマーに影響が出るものもある。
3) GAPDH含めすべてのプライマーに影響が出る
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