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(無題) 削除/引用 No.8177-9 - 2019/08/22 (木) 20:44:52 - 名無し monさん ご返信ありがとうございます。 確かに同じメチルセルロースよりも寒天を下層においたほうが良い結果ぎ得られそうです。参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.8177-8 - 2019/08/22 (木) 13:02:38 - mon 軟寒天培地はある温度をキープするなどやや扱いずらいので、薄いアガロース培地の上にメチルセルロース培地でも良いかも。

(無題) 削除/引用 No.8177-7 - 2019/08/22 (木) 11:40:20 - 名無し monさん、ご返信ありがとうございます。 自分なりに調べてみた結果、確かにnoble agar以外でも正常に実験を行えているものもあるようですね。本研究室にも電気泳動用のグレードが高いagarがあるため、検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.8177-6 - 2019/08/22 (木) 11:34:20 - 名無し おおさん、ご返信ありがとうございます。 今回のプロトコルにおいて、細胞を5mLの半固形培地に播種して懸濁する際に細胞がディッシュ底面に接触していた可能性はあると思います。 現在、5mLでは培地層の厚みがなく、細胞がdishに付着しやすいのではないかと考え、15mLほどに培地層を増やして培養を行っています。これでも改善されなかった場合、おおさんが仰るように高粘度のメチルセルロース層をひいてみることを検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.8177-5 - 2019/08/22 (木) 06:08:14 - mon ＞noble agarが高価な物 DNA電気泳動用のアガロースを使っていた先輩がいました。 ただしグレードによるかもしれません。低電気浸透度標品だったかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8177-4 - 2019/08/22 (木) 02:41:03 - おお たまたま底の方にあった細胞がディッシュについて増えた可能性はないでしょうか？ 実際にやっているかどうかはわかりませんが、少し濃い目のメチルセルロース含有培地をひいてその上に細胞をけんだくしたメチルセルロース含有培地をのせてやるとどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8177-3 - 2019/08/21 (水) 18:58:28 - 名無し Mさん、ご返信ありがとうございます。 ソフトアガーを用いた方法も初めに検討したのですが、noble agarが高価な物であったため、先に比較的安価で操作も単純なメチルセルロースによるコロニーアッセイを試した次第です。 現在用いているA549細胞（ヒト肺がん細胞）は付着性の細胞であり、用いている60mm dishも通常の培養に用いるもので特別な仕様ではないので、この方法は向いていないかもしれません。 低接着性プレートの使用やソフトアガーによるアッセイも検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.8177-2 - 2019/08/21 (水) 16:35:01 - M お使いの細胞では、メチルセルロースを使う特別な理由があるのでしょうか？　メチルセルロース単層のコロニーアッセイは、造血前駆細胞由来のコロニー検出に使われますが、付着性の細胞に分化すると底面に付着します。なので、もともと付着性の細胞を使った足場非依存性増殖の検出にはあまり向いてないように思います。ただし、低接着プレートを併用すれば、メチルセルロースでも足場非依存性増殖を検出できるようです（下記）。このプロトコールでは0.6%メチルセルロースのようです。私自身はこのプロトコールを試した事はありません。 ttps://www.cellseed.com/product/003-1.html 一般に、足場非依存性増殖の検出に用いられるのは、ソフトアガー（二層）を用いた培養法だと思います。もし、ソフトアガーでもよければ、こちらを試してみては如何でしょう？　ビデオ付きで下記に紹介されてますよ。 ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4353381/

メチルセルロースアッセイについて 削除/引用 No.8177-1 - 2019/08/20 (火) 15:43:58 - 名無し 初投稿です。研究室に配属され間もないためかなり初歩的な質問ですがご容赦ください。よろしくお願いします。 がん細胞株の足場非依存性を確認するために、メチルセルロースアッセイを行いました。 【以下細胞培養に使用した培地作製の概略です】 粉末培地から作製した2倍濃縮培地および3%メチルセルロース#4000溶液を等量の割合で混ぜ、最後に終濃度15%となるようにFBSを添加したもの。 この半固形培地を6cm dishに5mL加え、細胞を1 dishあたり300個ほど播種し、 インキュベーターで10日間培養しました。しかし、10日後に顕微鏡で観察してみたところ、細胞がdish底面に付着して増殖してしまっており本来予想していた半固形培地中での丸いコロニーを観察することができませんでした。 そこでお聞きしたいのですが、半固形培地中で細胞コロニーが形成されなかった理由はどのようなことが考えられるのでしょうか。メチルセルロースの粘度や細胞密度の変更、低接着プレートの使用などで改善がみられるのかを教えて頂きたいです。 拙い文章、および低レベルな質問かもしれませんが、よろしくお願いします。

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