BioTechnicalフォーラム [小麦種子からのDNA抽出について]

小麦種子からのDNA抽出について

No.8197-TOPIC - 2019/08/27 (火) 20:57:38 - 実験3年目

実験室3年目です。宜しくお願い致します。

小麦種子からDNAを抽出→PCRで遺伝子型を判別することになりました。
約3000粒の種子のDNAを一人で抽出しなければなりません。
予算の関係からキット使用はできません。

【予定している抽出方法】
種子１粒～半粒を金槌で潰す→抽出バッファー溶液を入れて混ぜ合わせる→遠心して上澄みをイソプロパノール沈殿→エタノールでリンス

この方法で大丈夫でしょうか？抽出バッファーにはメルカプトエタノールを入れた方が良いですか？

【PCRに使う酵素】
takara rtaq　か　プロメガgo taq を予定しています。使用マーカーは公開されているものです。

すみませんが宜しくお願いします。
　

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おお様　SYBR master

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No.8197-13 - 2019/08/29 (木) 21:24:51 - 実験3年目

おお様、ありがとうございます。
皆様からご回答頂いて勉強になりました。
思い切って質問書き込んで良かったです。
おお様が貼って下さった論文に目を通しました。
試薬の在庫がありで明日から両方試してみます。CTAB法ももちろん。

SYBR master様、詳しく説明して下さってありがとうございます。
仰る通りです。
結果のことしか眼中に無い状態でした。量が多すぎて混乱。まず何から手をつければ良いのか。そうだ！まずは、抽出方法と使用酵素を決めないと！で、焦ってあちこち調べてこちらを発見しました。

皆様からの論文や島津製作所のkit、アタマに無かった泳道のお話などを読みまして落ち着いてきました。落ち着くほどに真っ青になってます。
マルチチャンネルピペットはありましたが試してみたら使い物になりませんでした。無理かも。
タイムスケジュールも作成して、上司と相談します。（上司は出張中で来週から出勤）
ありがとうございます。感謝。

(無題)

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No.8197-12 - 2019/08/29 (木) 10:19:43 - SYBR master

パン小麦ならゲノムサイズがでかい(17 Gb)ので、1コピー当たり17 pgのDNA量なので、PCRで確実に走る1000コピー程度だと、ミトコンドリアや葉緑体DNAも加味すると20 ng、1反応のPCRには必要です。

小麦の種子1粒の重さが、30-40 mgで、100 mgから期待されるDNA抽出量が、3-5 マイクロgです。なので、一粒から良いとこ1マイクロgのDNAしか取れないので、エタチンかますとたぶんロスする可能性が高いですねぇ〜、キャリアー使うなりよほど慎重に行わないと。数を考慮すれば簡易抽出しか無理。簡易抽出するにしても、1.5 mLチューブではその後の作業も、個別分注しか無くなるので、96穴plateでないとかなり難しいと思う。

いっそ発芽させて、子葉と根から抽出した方が、DNA量は確保できそうだし、スターチによる阻害も無視できる。DNA量確保できそうならPCR用の簡易抽出もできると思う。私なら、実験対象では無い種子で、発芽、子葉・毛根回収、凍結し凍ったまま破砕・簡易抽出、PCRまでを予備実験として行うと思います。で発芽までに必要な時間とか算出し、実際どれ位の日数掛かるのか見積もりを出して、期日までに可能な実験系であるかどうか、相手に訴えると思います。

96穴 plate でnega-,posi-コントロール含めて少なくとも32回PCR。電気泳動は96 wellの装置で無ければ、mupidの大きいゲルで、17 well のを使用して、プレート1枚の結果確認に8回流さなければいけないので、合計252回。DNA抽出に予算を出して貰えないなら、少なくとも電気泳動の部分で、少なくとも1度に48サンプルぐらい確認できるようにしないと、やる気にはなりませんね。あと８チャンネルピペットとか、連続分注ピペットも要求します。明らかに腱鞘炎になりそうな数だし。

(無題)

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No.8197-11 - 2019/08/29 (木) 01:47:11 - おお

https://shigen.nig.ac.jp/ewis/article/html/118/article.html

SDSをふくむ溶液で溶解して酸性条件下で蛋白や夾雑物をSDSとともに沈殿して上清のDNAをエタ沈する方法ですね。
２５ｕgぐらい取れるって書いてるかな。

https://www.future-science.com/doi/full/10.2144/000114286
これは効率化をしようとしているようですが、要は砕いてNaOHで溶かして、中和して一部をPCRに使う方法。

(無題)

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No.8197-10 - 2019/08/28 (水) 23:46:53 - おお

あ、そうか効率も必要なんですね。

確かに材料をほぼそのままぶち込んでPCRという感じの事もやる事はあると思います。砕いた小さなかけらをそのままPCRというのも出来ないともいえないでしょう。どれくらいPCRに影響があるものが含まれているかとプライマーの出来次第ではそれでもうまくいくものです。ただ私はDNAの含有量を知らないので、、、

面倒ならそのまま粒をいれてPCRしたくもなりますが、、、米みたいに膨れたゲルみたいになるのかも、、、

もう一つて間が少なそうなのはシリカというかグラスミルクみたいなものだと思います。材料を溶解しながらゲルを入れて吸着してしまえば上澄を捨てて洗浄、溶出なので溶出まで１チューブです。

(無題)

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No.8197-9 - 2019/08/28 (水) 20:49:59 - 実験3年目

mon様、ありがとうございます。
早速読んでみます。

ちき様、ありがとうございます。仰せの通り、ラボの上司から指示が出た時には気持ちが一気に下降しました。予算が無いと釘を刺されているため購入却下の場合も考慮して再度の質問になりました。
橘様からの島津製作所のAmpdirecは初耳で良いことを教えて頂きました。taqは節約しても問題ないとこれも大変有難い情報です。

今回は①Ampdirec購入をお願いする。説明書の反応系は20μ　これを10μ以下で試してみる。②購入がダメならCTAB法を試す

ば気持ちが萎えておりますがなんとか進めていきます。ありがとうございます。

(無題)

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No.8197-8 - 2019/08/28 (水) 13:34:29 - ちき

なんか話の流れが見えませんが、、

3000個の種子をどのくらいの期間でgenotypingする計画なのかわかりませんが、普通に考えて、DNA抽出をはさむ工程を手作業でやるのは相当きついと思います。したがって、lysateからそのまま(DNAを抽出せずに)PCRできる試薬として、橘さんがAmpdirectを紹介されたのだと思うのですが。大腸菌や酵母ならcolony PCRするところです。それでも3000はかなり大変でしょう。

なお昔酵母のgenotypingを頻繁にしていた時は、Taqを節約するためPCR反応のvolumeはぎりぎりまで少なくしていました (5 microL、これを全量泳動)。条件が決ってしまえば、これで十分でした。何かの参考になれば。

(無題)

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No.8197-7 - 2019/08/28 (水) 12:19:35 - mon

CTABが汎用されるようです（使用経験ない）
agriculture.uq.edu.au/files/5650/plant-genomic-dna-extraction-by-ctab-2-fiona.pdf

おお様

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No.8197-6 - 2019/08/28 (水) 09:29:53 - 実験3年目

何度もすみません。

デンプンが多い場合のDNA抽出について調べてみましたが
適当なものを見つけることができませんでした。

DNAすいすいーSを発見しましたがコストを考えると・・。

もし、おわかりになることがありましたら
お手数ですが宜しくお願いします。

おお様　橘様

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No.8197-5 - 2019/08/28 (水) 08:09:03 - 実験3年目

ご返信ありがとうございます。

島津製作所のキットの購入をお願いしてみます。
思ったよりも安価でした。
ありがとうございます。