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(無題) 削除/引用 No.8214-10 - 2019/09/05 (木) 07:43:21 - おお >最初のブロットの時に結合した抗体が多少なりとも解離して、抗体溶液を汚してしまうのじゃないかと思ったのです。 アクチンなど非常にアバンダントで強いシグナルの出るものを先にプローブするとそういうことはありえると思います。ストリッピングを厳しい条件でやるか（ただそうするとかなり次のシグナルが弱くなる）、シグナルが強いものをあとに持ってくるようにするか。

(無題) 削除/引用 No.8214-9 - 2019/09/05 (木) 07:06:18 - 倹約家 Native Pageのときに、SDSに浸してからトランスファーすることは知りませんでした。いいアイデアですね。 私が心配しているのは、リプローブすることによって、抗体溶液が汚れてしまうのではないかと危惧したのです。 抗体の再利用が、いつも新規のメンブレンに用いられるのであれば、だんだんとシグナルは弱くなっていくかもしれませんが、特に心配はしていません。 抗体とターゲットの結合は強固なものでしょうし、膜状に結合した抗体の量もそれほど多くはないのと思われますが、それでも最初のブロットの時に結合した抗体が多少なりとも解離して、抗体溶液を汚してしまうのじゃないかと思ったのです。 もちろん、論文用には、新しい抗体溶液でやり直せばいいことではありますね。 色々な意見、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8214-8 - 2019/09/05 (木) 02:43:43 - おお >抗体液の再利用は保存状態には影響受けるかもしれない。特にmilkやBSAが入ったbuffer中では雑菌の繁殖が一番心配.だけど0.05%前後のTween 20も添加されてればそれはある程度防げるかもしれない。S azideも入れたほうがいいと思う。 保存することを考慮して、非蛋白性のブロッキング剤を使ってます。PVPで探してみてください。分子量が大きいものと小さいものがあるのですが、大きい方は保存中に沈殿ができますが、上澄みを使えば大丈夫です。小さい方はたぶんそれほどではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.8214-7 - 2019/09/04 (水) 18:00:48 - $%$$$$%6 自分では再利用はしてないけど抗体はタンパク質のうちでは割と丈夫な方なので、２、３回くらい再利用しても活性は維持してると思う。昔、30回くらい再利用してる抗体液借りたことある。市販されてない抗体で自作したがウサギに再免疫してもいい抗体が２度とできなくて、いい抗体はその抗体液しかないらしい。 抗体液の再利用は保存状態には影響受けるかもしれない。特にmilkやBSAが入ったbuffer中では雑菌の繁殖が一番心配.だけど0.05%前後のTween 20も添加されてればそれはある程度防げるかもしれない。S azideも入れたほうがいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.8214-6 - 2019/09/04 (水) 05:16:34 - 節約 >そこで、質問なのですが、このようにリプローブに使った一時抗体は、再利用しても問題ないものなのでしょうか。 うちは再利用しています。一次抗体をBSAで希釈して使い終わったらチューブに戻して-20度で保存しています。ミルクでは使いません。反応は必ず4度で、室温ではしないようにしています。アザイドも入れてません。バンドが出なくなるまで何度も使っています。

(無題) 削除/引用 No.8214-5 - 2019/09/04 (水) 05:12:28 - M ネイティブページはあまりやりませんが、膜に転写した後で還元剤処理などは結構やってます。同様に、膜転写後に変性処理もできると思うので、抗体入れる前に処理すれば良いのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8214-4 - 2019/09/04 (水) 05:06:46 - M リプローブは基本ストリップ無しでやっており、使った抗体も再利用できるかどうか、一回は試してみてから以後どうするか決めてます。特に問題なく再利用できている場合も多いですが、あくまで私の個人的経験であり、人様にお勧めできるようなものではありません。研究資金が潤沢にあって、抗体の購入に抵抗感がないラボで仕事していれば、毎回フレッシュな抗体を使うのが良いと考えるのは、当然ですよね。

(無題) 削除/引用 No.8214-3 - 2019/09/03 (火) 15:32:14 - おお 非常に弱いシグナルしか出ない抗体で検出した場合、次の検出が異種の抗体ならストリップしません。 ＞この未変性と思われる酵素は転写後の膜状でも作用を発揮して抗体になんらかの影響 トランスファーの条件で変性する蛋白は多いと思いますが、メタノール２０％でもそう活性が維持できるものではないと思いますが。 抗体の特異性が変わるような酵素反応って何をイメージしているんでしょうか？プロテアーゼとかによる分解？ とにかく気になるならTransfer前でもTransfer中でも後でもいいから変性すればいいと思いますけど。 私はNativeのばあいはSDSPAGEのRunning buffer（０．１％SDSが入っている）で数分IncubateしてTransferしてます。

(無題) 削除/引用 No.8214-2 - 2019/09/03 (火) 10:06:41 - asan >そこで、質問なのですが、このようにリプローブに使った一時抗体は、再利用しても問題ないものなのでしょうか。 大丈夫かどうかは一概には言えません、基本的に抗体量が過剰量あるという前提で実験をしてるものである以上使い回せば薄くなったりへたってきたりする抗体なんてたくさんあります。 ただ、個人的にはtubulinとかインターナルコントロール以外はそもそも使い回したりはあまりオススメしてません。リブロットウンぬんもあなたが懸念するような理由からコンタミしたりするリスクもあるためそれならハイブリパック等につめて節約した方が確実と考えてました。が、考え方は自由です。 >この未変性と思われる酵素は転写後の膜状でも作用を発揮して抗体になんらかの影響があると考えて、抗体の再利用は避けるべきでしょうか。 阻害剤がなんなのかとかよくわかりませんが、ネイティブページだからダメ通常の変性したSDS-PAGEならOKとか端的にはそんなものではないと思いますが。

抗体の再利用 削除/引用 No.8214-1 - 2019/09/03 (火) 03:57:46 - 倹約家 ウエスタンの時に使われる一時抗体は、回数を決めて、もしくはシグナルを見ながら、再利用されてる方もいらっしゃるかと思います。 また、メンブレンをストリップして、リプローブしたり、時には、ストリップなしでリプローブしたりする方もおられるます。 そこで、質問なのですが、このようにリプローブに使った一時抗体は、再利用しても問題ないものなのでしょうか。 もう一点は、組織抽出液のネイティブページをやってウェスタンをする時があります。組織抽出液を作るときは、阻害剤を入れてやっていますが、電気泳動後は、これらの阻害剤は、不可逆阻害のものを除いて、作用していないと思います。この未変性と思われる酵素は転写後の膜状でも作用を発揮して抗体になんらかの影響があると考えて、抗体の再利用は避けるべきでしょうか。 以上、二点について考えを教えてください。

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