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(無題) 削除/引用 No.8231-8 - 2019/09/06 (金) 16:53:39 - B4 プラスミドチェックしてみます。

(無題) 削除/引用 No.8231-7 - 2019/09/06 (金) 16:52:19 - ちき 波形が出ていないというのは、何で見て、ですか? rawシグナルを見ても、バックグラウンドレベルということですか? もしそうなら、何かを入れ忘れたか、アニーリングサイトがないか、サーマルサイクラーがおかしいかぐらいしか、、、 弱いながらも何か出ている(解析はされていないのでNNN..と表示されている)なら、対処法がありそうですが。

(無題) 削除/引用 No.8231-6 - 2019/09/06 (金) 16:50:42 - AP >変なプラスミドを拾ってきたということはないと思います。 少なくとも現に今、おかしなことが起こっているんだから、言われなくても当然、プラスミドのチェックはすべきだな。

(無題) 削除/引用 No.8231-5 - 2019/09/06 (金) 16:48:08 - AP >インサート入りプラスミドはキットを使って精製し，NanoDrop　を用いて吸光度を測定しました。その結果，濃度，吸光度とも問題ない値をとっていました。 電気泳動で定性、半定量的な試験をすべき。 吸光度による定量は干渉要因が多く、誤差が大きいので過信しないほうがいい。電気泳動なら品質（サイズ、夾雑している核酸）もわかるし、既知量のマーカー（サイズマーカーでよい）との比色で妥当な濃度見積もりができる。 対象のプラスミドは何らかの方法で目的のものであるかどうかvalidateしているのだろうか。例えば、制限酵素消化パターンが一致するかどうかを見るとか？　新しく拾って精製したプラスミドなら、当然やるべき手順なのであらためていうことでもないことですが。 コンタミやライゲーション反応で生じた副産物などに由来する、おかしなプラスミドが入ったクローンは頻繁にある。薬剤耐性、複製オリジンなんかはあっても、インサートやプライマーアニールサイトなんか持たない奴かもしれない。 >コロニーPCRで当たりバンドから、液体培養しているので、変なプラスミドを拾ってきたということはないと思います。 あまいな。 コロニーPCRは迅速にスクリーニングするための手段に過ぎない。取れたものについてはプラスミドを精製した上でちゃんと確認しなければいけない。コロニーPCRなんで偽陽性が出やすいんだから。例えば、形質転換菌をプレート上にまいたときに一緒に塗りたくられるライゲーション産物中のDNAなんか鋳型になる。

(無題) 削除/引用 No.8231-4 - 2019/09/06 (金) 16:41:10 - T-2 なぜプライマーを２種類いれるのですか？

(無題) 削除/引用 No.8231-3 - 2019/09/06 (金) 16:26:34 - B4 波形がそもそも出てなくて、NNNNNしか表示されていませんでした。 インサートについては、コロニーPCRで当たりバンドから、液体培養しているので、変なプラスミドを拾ってきたということはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.8231-2 - 2019/09/06 (金) 15:57:03 - おお 読めないって言うけど波形とかどうなってるのよ。そういるデーターを見ながら診断していくもんでしょう。 インサートを入れたというけどうまくはいってなくって変なプラスミドを拾っただけとかいう話だったりしない？

DNAシークエンスにおいて塩基が1つも読めない 削除/引用 No.8231-1 - 2019/09/06 (金) 14:51:09 - B4 ほ乳類細胞ベクターにインサートを挿入したプラスミドを精製したのですが，シークエンスが上手く行きません。 インサート入りプラスミドはキットを使って精製し，NanoDrop　を用いて吸光度を測定しました。その結果，濃度，吸光度とも問題ない値をとっていました。 そのサンプルを使ってシーケンスを行ったのですが，全てのサンプルについて，N（未決定塩基）しかでず，何一つ塩基が読めませんでした。 同じプロトコールで，違うサンプルを用いてシークエンスを解析したところ正しく読めていたため，サンプル側に問題があると思ったのですが，どこに問題があるのか分からずここで質問いたしました。 お答えいただけると幸いです。 プロトコール プラスミドDNA(200ng 相当量)　X μL 5 x Sequence buffer　　 2 μL Primer (1.6 pmol/μl) 　 *pcDNA3.1-Sequence-F 　　 2 μL 　 *pcDNA3.1-Sequence-R 2 μL Big Dye pre-mix 　 　　　2 μL D.W.　　 　　　　　　　　 　X μL ＊それぞれ1 tube ずつ調製 サーマルサイクル：（94℃，30 sec，50℃，20 sec，60℃，10 min）x35 cyc サーマルサイクリング後， D.W. を10 μL加え，30 μLの 2-propanol を加え，ピペッティングにより混合した。 ↓遮光　15 min 静置 ↓14,000 rpm，20 min，25℃ 上清を除いた。 70 %エタノールを125 μL加えた。 ↓14,000 rpm，5 min，25℃ 上清を除き，ペレットを真空乾燥機で乾燥させた。 20 μLの Hi-Di Formamide を加え，ピペッティングによりペレットを溶解した。 ↓95℃，2 min（サーマルサイクラーで） ↓氷上5分，静置 シークエンス解析 シークエンサーは，DNA Sequencer （ABI 社 3130xl）のもので，プライマーはコロニーPCRに使った物を使用しました。

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