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薬剤のオフターゲット効果の検索方法 トピック削除
No.8256-TOPIC - 2019/09/18 (水) 22:34:23 - nak
ある酵素Xによって触媒されると報告されている細胞内の蛋白質の修飾について研究しているのですが、最近全くの偶然に、別の酵素Yを阻害する阻害薬Aにより修飾が阻害されることが判明しました。
面白いことに、その細胞においてはXの阻害薬Bでは反応が阻害されず、阻害薬Aでのみ綺麗に阻害されてきます。よって、その細胞においては既報に無い新規の機序による修飾が起こっているものと考えられます。
当然、酵素Yがそれを起こしているものと考えて、確認のために酵素Yの別の阻害薬CおよびDを試してみましたがそちらでは阻害がかかりません。阻害薬A、C、Dいずれも細胞内で酵素Yを阻害できていることは別の実験により確認できました。
よって、阻害薬Aが酵素Y以外に作用する、オフターゲット効果に意味があるものと予想されます。
販売元のWebページ上にはIC50は高いもののいくつかの酵素に作用しうることが記載されており、それらに特異的(とされる)別の阻害薬をいくつか試しましたが、いずれも蛋白質の修飾を阻害できませんでした。
よって、阻害薬Aには、Webページに記載のない他の酵素Zに対する作用があることが予想されます。そして、その酵素Zがこの蛋白質の修飾を起こしているのだと考えられます。

そこでご質問なのですが、ある阻害薬がオフターゲット効果を及ぼしうる酵素を見つける手法はなにかありますでしょうか?
当方免疫屋さんで、化学についての知識が無く、どうして良いものか途方に暮れております。
何らかのデータベースで検索可能であるとかありますでしょうか?
どうかよろしくお願い申し上げます。
 
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No.8256-7 - 2019/09/26 (木) 03:07:24 - nak
> asan様
ありがとうございます。
おっしゃる通り何を「オフ」というかは恣意的なものですが、今回についてはその薬剤が「酵素Yの阻害剤」として販売されているので、そのY以外のものに対する反応を指してオフターゲット効果、と私は称しています。
当然のことながらY以外についてはIC50はかなり高くなっています。

低分子化合物なので自分になじみのある蛋白や核酸を扱う時のような実験手法が使えなくて、さてどうしたものか、と悩んでの質問でした。
今回の興味事項はこの阻害剤がある反応を抑えるから役に立つとか立たないとかいうことではなく、この反応自体にありまして、どういう機序でこうしたことが起こっているのかを解明したいと思っています。したがって、この阻害剤が何に効いているかは何とか解明せねばならない事項で、けっこう頑張らなければならないポイントなのです。。。

(無題) 削除/引用
No.8256-6 - 2019/09/23 (月) 16:18:08 - asan

そもそも、オンターゲットとオフターゲットの議論は何を持ってオフかオンかというのは非常に難しい議論であって、結局IC50とか有効濃度のウインドウ次第でどうにでもなってしまう議論だと思います。

ただ、一般論をいうと、protein-protein結合を抑制したり、DNA-転写因子などの比較的平たい広い”面”をターゲットにする薬剤ってのは低分子化合物でターゲットにするのは非常に難しい場合が多いし、一方でほとんどのキナーゼ阻害剤などのATP competitiveなものや、一般性のある酵素活性中心にハマって抑制するものはその作用機構的に類似する他の酵素にも多少なりともアフィニティーがあるのは結構当たり前のことだったりします。

ごく一部のアロステリックな阻害剤、例えばrapamycinなどの特殊な例は非常に特異性が高いことが多いですが、現状このレベルの複雑な構造のものでねらった薬理活性をもたせるのは非常に困難で、故にほとんどの特殊な阻害作用を示す化合物は天然由来のポリペプチドに近いものだったりするでしょう。


オフターゲットの探索については、すでに回答があるように、in silicoで予想するだろうが、ビーズに固定してダイレクトな結合因子を釣ってくる方法だったり、GPCRなどのレポーター細胞でスクリーニングかけたり、最近だとMSおThermal shiftを利用するなどいろいろな案はありますけど、それぞれ自体が一つの研究テーマや研究アプローチとして成立するようなものばかりだと思うので一概に言えませんよ。

基礎研究レベルで利用するのであれば、あくまで活性を抑えるけどそれが唯一のターゲットとは限らないという前提で、いろいろな角度での証明が求められるという考え方でいいのではないかと思います。それこそ論文の求めるレベルに応じて。

(無題) 削除/引用
No.8256-5 - 2019/09/22 (日) 00:33:09 - nak
おお様

ありがとうございます。
まずはin silicoから出来ることをやってみます!

(無題) 削除/引用
No.8256-4 - 2019/09/19 (木) 05:37:02 - おお
ビオチン化は自前で化学合成しているか、合成依頼しているでしょうね。多分あまり活性に関係のないところにアミンを導入したりしているんだと思うけど。

Bioinformatics的にできることもありそうですが。
その酵素活性を担うようなモチーフを持った遺伝子を片っ端から集めてリストにするところまでは大抵の人できるのではと。数が少なければそれぞれshRNAなどでノックダウンしてどれが修飾しているかとか探せそうな気がするし。

データーベースでInteractorsを探してなにかそれらしいものがあるかとか。

(無題) 削除/引用
No.8256-3 - 2019/09/19 (木) 05:04:40 - nak
> おお様
いつも何かしら前に進むために有益な助言をいただき、感謝しています。
さて、薬剤をビオチン化してプルダウンするというのはとても合理的で良さそうに思えるのですが、当方、蛋白質以外をビオチン化した経験がありません。
低分子化合物でもビオチン化できるものなのでしょうか?

対象としている薬剤は分子量400程度の低分子化合物であり、かつ、ThermoFisherのホームページなんかに載っている、ビオチン化の標的となるような官能基は無さそうに思われます。

(無題) 削除/引用
No.8256-2 - 2019/09/19 (木) 00:55:27 - おお
ちょっと登場人物が多くて私の頭の整理がついてないのだけど、薬剤をビオチン化してプルダウンし、マスでターゲットの蛋白同定する方法はよく見かけます。その他蛋白相互作用でスクリーニングするとかも利用できそうなきがします。

薬剤のオフターゲット効果の検索方法 削除/引用
No.8256-1 - 2019/09/18 (水) 22:34:23 - nak
ある酵素Xによって触媒されると報告されている細胞内の蛋白質の修飾について研究しているのですが、最近全くの偶然に、別の酵素Yを阻害する阻害薬Aにより修飾が阻害されることが判明しました。
面白いことに、その細胞においてはXの阻害薬Bでは反応が阻害されず、阻害薬Aでのみ綺麗に阻害されてきます。よって、その細胞においては既報に無い新規の機序による修飾が起こっているものと考えられます。
当然、酵素Yがそれを起こしているものと考えて、確認のために酵素Yの別の阻害薬CおよびDを試してみましたがそちらでは阻害がかかりません。阻害薬A、C、Dいずれも細胞内で酵素Yを阻害できていることは別の実験により確認できました。
よって、阻害薬Aが酵素Y以外に作用する、オフターゲット効果に意味があるものと予想されます。
販売元のWebページ上にはIC50は高いもののいくつかの酵素に作用しうることが記載されており、それらに特異的(とされる)別の阻害薬をいくつか試しましたが、いずれも蛋白質の修飾を阻害できませんでした。
よって、阻害薬Aには、Webページに記載のない他の酵素Zに対する作用があることが予想されます。そして、その酵素Zがこの蛋白質の修飾を起こしているのだと考えられます。

そこでご質問なのですが、ある阻害薬がオフターゲット効果を及ぼしうる酵素を見つける手法はなにかありますでしょうか?
当方免疫屋さんで、化学についての知識が無く、どうして良いものか途方に暮れております。
何らかのデータベースで検索可能であるとかありますでしょうか?
どうかよろしくお願い申し上げます。

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