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(無題) 削除/引用 No.8280-8 - 2019/09/30 (月) 00:12:37 - Watchman おお様 ちき様 ＞実際に文献でそういう手法を示しているのはどうだろうか、、、 確かに、CyclinEの発現変化→細胞増殖と示しているものは読んだことはないです。 細胞周期が完全に同期していなければCyclinEが増加しているのもみるのは難しいのは、確かにそうですね。 CyclinEよりもCyclinDの方が多く論文で見受けられるのは私もそう感じます。 ただ、私の研究室ではCyclinDよりもEを重く見ているみたいです。 皆さんのおっしゃる様にまずはBrdUを行い、実際に細胞増殖が起こっているのかを確認し、 CDK２やRbのリン酸化をウエスタンで見るのと同時に細胞増殖マーカーであるKi67も見ていて行こうと思います。

(無題) 削除/引用 No.8280-7 - 2019/09/29 (日) 16:25:58 - ちき 制限点を越えるのにG1/S-Cdkの活性の上昇は勿論必要なのですが、cyclin Eレベルの明らかな上昇が必ず観察されるかは存知ません。一般にG1/S-Cdkの活性の上昇は、1) cyclin Eの転写レベルでの増加、2) (cyclin Eがある程度存在した上で、)CDKI(p27等)とCDK2-CyclinEとの解離、の両方によって実現されると理解しています。実際そのような例が存在するかわかりませんが、2)が卓越するような状況があれば、必ずしもcyclin Eの増加は見えないのでは。それよりは、おおさんの指摘にあるように、Rbのリン酸化状態などG1/S-Cdkの活性そのものの指標を見たほうがいいように思います。また個人的な印象ですが、cyclin Eをマーカーにしている論文はcyclin Dほどは多くない気がしています。 もうひとつは、WBで細胞集団アンサンブルを観察する際の問題です。増殖フェーズに入っても細胞周期が同調していなければ、G1/S境界におけるCyclin Eの一過性上昇は、それほどはっきりしないのではないですか。非同調集団に対しては、増殖マーカーの免染や、BrdU/EdUの取り込みを見る方法のほうが、個々の細胞を観察できる点で優れていると思います。

(無題) 削除/引用 No.8280-6 - 2019/09/29 (日) 13:55:34 - おお >CyclinEは細胞周期の亢進を証明するよくある手段 実際に文献でそういう手法を示しているのはどうだろうか、、、 ま、例えば３０％のS期が４０％とになったとしてどれほどウエスタンで差が検出できるだろうか。そんな状態でも３日もすれば２倍細胞数で違いがあってもおかしくはないし。またG2Mの抑制が解けるような場合だとG1Sの抑制が解除されるよりはCyclin Eの変動は見にくいかもしれない。要は細胞周期がシンクロしてないと差を見にくいと思う。もしかしたらCDK2のリン酸化（Westernでダブレットになるので検出しやすいとおもう）とかRbのリン酸化見たほうが見やすいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.8280-5 - 2019/09/29 (日) 12:00:36 - Watchman 　ちき様　 　み様 ご回答ありがとうございます。 確かに細胞死が抑制されることで増殖しているように見えることも考えられますね。 その方面でも少し考えてみます。 いくつか細胞周期についての文献を読みましたが、G1チェックポイントを超えるためにはCyclinEが必要であり、それがないと細胞周期が亢進しないと考えていました。 ただし、CyclinにふれずにKi67やPCNA、MCM-2の免染などで増殖の話をしている論文も見受けられました。 ですが、CyclinEは細胞周期の亢進を証明するよくある手段という印象です。 WST-8はおっしゃる通りミトコンドリア活性を測定しており、間接的に増殖を測っていますので、BrdUをやって実際に増えているのかどうか検証してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8280-4 - 2019/09/29 (日) 00:23:49 - み WSTはﾐﾄｺﾝﾄﾞﾘｱの酵素活性みてるだけで本当に細胞が増えてるかは分からない。 単純に細胞数えてみたらどうだ。 BrdU,EdU取り込みという案には賛成。

(無題) 削除/引用 No.8280-3 - 2019/09/28 (土) 22:31:57 - ちき 教科書的にはE2Fでcyclin E発現が上昇するのは存じていますが、実験上どの程度robustなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8280-2 - 2019/09/28 (土) 22:12:03 - ちき 刺激前は増殖と細胞死が釣り合っており、刺激後は細胞死が抑制されて見かけ上増殖が亢進しているように見えるという状況は理屈上はあり得ると思います。 ところで細胞周期進行が亢進していることを示すのにcyclin Eの発現を見るのは妥当な方法なのですか。こんな論文もあるみたいですが。 https://mp.bmj.com/content/56/6/353 自分でやるとしたら、FACSでDNA含量プロファイルを見る、BrdU (or EdU)の取り込みを見る、Ki67の免染をするなどでしょうか。

細胞増殖と細胞周期の関係について 削除/引用 No.8280-1 - 2019/09/28 (土) 15:50:48 - Watchman 現在、関節リウマチ滑膜細胞の培養をしており、その増殖活性をWST-8で測定をし、様々な刺激による増殖能の変化を見ています。 WST-8で細胞増殖活性が増加していることが分かり、次に何が原因で、どういった機序で細胞増殖が起こっているかどうかを調べているのですが 細胞増殖＝細胞周期の亢進　だと考えてまずはCyclinEの発現を転写、翻訳レベルで見たですが、想定していたような結果にはなりませんでした。 細胞が増殖しているという事は細胞周期が亢進している(CyclinEの発現が増加さしている)という事と同義ではないのでしょうか。 また、細胞周期が関連しないような増殖機序はあるのでしょうか。

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