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(無題) 削除/引用 No.8293-10 - 2019/10/08 (火) 23:03:41 - ちき full lengthのTaqは5'->3' exoの活性はあると思いますが、Pfu系はなかったような。ただし、検索するとPfuやTaqのStoffel fragmentでもAFLPができると言ってる人もいるみたいですね。 その辺は、72°Cでどのくらいアダプターのつながっていない方の鎖がはがれるか、との兼ね合いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8293-9 - 2019/10/08 (火) 17:09:01 - たのすけ ありがとうございます。 熱変性を加えないということは、伸長方向にアニールしたアダプターがまだついてたりついてなかったりだと思います。 ニックから先の削って乗り越えながら進む5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が必要な気がするのですが、PCR用のポリメラーゼはどれでも普通5'→3'エキソヌクレアーゼ活性があるものでしょうか？ リアルタイムPCR用のポリメラーゼなら、プローブ分解のためにその活性はあると思うのですが、通常のPCR用のポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性は取説に載ってないので、少し選択に迷ってます(校正活性の3→5エキソヌクレアーゼ活性については各社熱心にアピールしてるのですが)

(無題) 削除/引用 No.8293-8 - 2019/10/05 (土) 09:30:34 - ちき 一度変性したゲノム断片が相補鎖と再anealする効率は100%ではないはずので、94°Cのステップを経ると原理的にはPCR産物の収量が下がると思います。どれくらい影響があるかはやってみないとわかりません。 preselective PCRでは通常のTaq、selective PCRではhot-startと使い分けているプロトコルもあるようです。 https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/A_2015A.pdf

(無題) 削除/引用 No.8293-7 - 2019/10/05 (土) 07:59:13 - たのすけ なるほど。 理解しました。 そうすると、最近のホットスタートの酵素だと都合が悪いですね。 たまたま、ラボにあるPCR用の酵素がホットスタートのものばかりなのですが、94℃にした後に72℃だとうまくいかないと思いますか？

(無題) 削除/引用 No.8293-6 - 2019/10/04 (金) 23:01:32 - ちき 標準的なのかどうか知りませんが、私が見たAFLPのプロトコルではいずれもPCRの前に72°C数分のステップを1回だけおいていたので、この間鋳型は変性せず、ライゲーションしていないアダプターの片方の鎖のみ外れ、合成が進んで端が平滑化するだろうということです。 例えばこれ。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3513352/

(無題) 削除/引用 No.8293-5 - 2019/10/04 (金) 21:40:56 - たのすけ 最初の72℃で埋まるというのは、最初のサイクルの時に、ゲノムとプライマーだけでなく、元のゲノム同士もアニールしてるはずで、アダプターとつながってないほうの鎖(ゲノムの3'とアダプターの5'で見かけ上つながるも、熱変性でアダプターの鎖は外れてどこかに)がプライマーとなり、アダプターと繋がったほうの鎖(アダプターの3'とゲノムのリン酸化5'でライゲーション)を鋳型に伸びていって平滑末端となる、という感じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8293-4 - 2019/10/04 (金) 00:30:52 - ちき 経験はないけど、プロトコルを見る限り最初のサイクルの前の72°Cで端までfill-inされるのでは？

AFLPアダプターについて 削除/引用 No.8293-1 - 2019/10/03 (木) 20:18:02 - たのすけ AFLP法でゲノム間の比較をしなければならないのですが、 どの文献をみても、アダプターは5'がリン酸化されてないようです。 そこのところが理解できません。 これだと、ゲノム側は5'リン酸化されてるのでアダプターの3'とつながりますが、ゲノムの3'とアダプターほ5'はニックが入ったままになるように思います。 大腸菌に入れるステップもないので、ライゲーション直後は相補鎖の水素結合でつながっていても、PCRのdenature過程で外れてしまうように思います。 これでは、プラスミドみたいに環状でない限り、PCRで増幅できないように感じるのですが、どういうことでしょうか？ また、「そんな前時代的な方法なんかじゃなく、NGSでブラストシークエンスとったら？」という回答も無しでお願いのします。

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