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(無題) 削除/引用 No.8314-7 - 2019/10/20 (日) 14:07:24 - おお 色々書きたいことはあるのだけどまとまらないのでどうしようとおもいつつも。 まず、siRNAが流行っていた頃、TransfectionしてからKDの効果でタンパク量が減るまで結構時間がかかるといった話を覚えています。mRNA量がへっていても、翻訳阻害がかかっていたとしても実際に目に見えて減るのはTransfectionしてから７２時間とかそんな感じ。その間にも細胞は増殖していくので導入されたsiRNAは希釈されるという理由でTransfectionを繰り返しやるプロトコールもまあまあ見られました。 また発現などはポジ、ネガのフィードバック機構はまあまああるかと思います。そういう意味ではあなたの結果はもしかしたら面白い切り口になるかもしれません。 mRNA、蛋白の変動がどの程度大きいかというのも解釈のうえで考慮することかもしれません。変動がそんなに大きくないとInternal controlの変動があればそれに結構左右されてしまいます。 言い出すときりがないですけど細胞全体の容積が変わるとか、総mRNA量の発現が減ったりとかでも結果に影響するものだと思います。

(無題) 削除/引用 No.8314-6 - 2019/10/19 (土) 15:05:07 - (´·ω·`) フェリチンとか一部のタンパク質を例外とすれば、mRNAとタンパク質は必ずしも互いに相談しながら、発現量を調節してるということではないだろうし、（RNA, タンパク質それぞれで独自の厳密なターンオーバーの分子機構を持ってるし）そういうこともあると思う。

(無題) 削除/引用 No.8314-5 - 2019/10/12 (土) 16:50:53 - asan 特に相関しないことが合理的な説明がつかないようなタンパク質ならば、まずはそのprimerでの増幅が本当に正しく見たいものを吐かれてるのか？とか抗体のバンドが本当に正しいものをみてるのか、とかそう言うのを疑ってもいいかもしれませんえ。 これらの可能性を排除するならば、例えばknockdownコンストラクトを作成して確実に減少する条件でちゃんと相関した結果が得られるかを検証してみるとかそういうので検証するのはアリだと思います。 ただ、一般論として言うなら、どんなに安定したタンパク質でもmRNAが1/10になってるのに全く変化がないタンパク質って基本的にはないと思うけど、せいぜい7割ぐらいしか落ちてないならそんなにタンパク量に変わらないようなロバストなタンパク質もありますよ。あとは既に述べられてるような安定性が高いタンパク質なら刺激後の変動には時間がかかるし、ノーマライズのせいでのブレとかいろいろね。

(無題) 削除/引用 No.8314-4 - 2019/10/11 (金) 18:07:21 - あおい 技術的な点でおもいつく点ですが、 ウェスタンの場合は、著明な差がない2サンプルを比較する場合は特に、きちんとネガコン、ポジコンを一緒に比較しないと差がわからないことがあります。 というのも、最期にdetectionで得られたバンドに対して、露光時間を長くしたり、検出強度を上げてしまえば大体濃いバンドが得られてしまうため、何が真実なのかよくわからなくなってきます。タンパクや使用する抗体・濃度でだいたいこのあたりの調整はできるようになってきますが、特に初めての抗体などの場合はdetectionの際の検証が必要です。 小さな差を見たいときこそ、ネガコン、ポジコンを一緒に検出する必要があるかと思いましたがそのあたりに関してはいかがでしょうか。 他に言うまでもないことですが、タンパクやＲＮＡ抽出した時間（反応を止めた時間）が異なれば当然発現レベルは異なる可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.8314-3 - 2019/10/11 (金) 15:59:13 - qq PCRの内部コントロールが適切に取れていないという可能性もあるかもしれない。 PCRで見たものがウェスタンで見ているタンパク質であるとは限らない。例えば、全く別のｃDNAの一部であるとか。 ウェスタンで見たタンパク質のバンド強度が、PCRで見ているものと完全一致しているとは限らない。複数の類似したタンパクの共通部分を見ている抗体であれば、qPCRの結果に反映しない可能性が出てくると思う。 ここで指摘したのはどれも実験デザイン上の問題になるなあ。 同じcDNAに対する別のプライマーセットでPCRしても同じ結果が出ることが最初かなぁとおもう。

(無題) 削除/引用 No.8314-2 - 2019/10/11 (金) 15:24:17 - おお 蛋白の半減期が（実験でみた期間より）長いとか。翻訳量の変化とか。

ウェスタンブロットとPCRの結果の不一致 削除/引用 No.8314-1 - 2019/10/11 (金) 15:13:59 - mirei PCRの結果では発現量が減っていた分子が、ウェスタンブロットの結果では変化が見られませんでした。 PCRとウェスタンブロッティングの結果の不一致ということはあるのでしょうか。

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