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(無題) 削除/引用 No.8345-17 - 2019/10/24 (木) 09:53:41 - K protein A/Gビーズを使用前にGlycine-HCl ~pH2.5に30秒くらい懸濁してすぐに中性の普通のbufferに変えて、何回か洗う。そのあと実験に使用する。この前処理で、ビーズにクロスリンク仕損なったproteinA/Gの多くは洗い流されるので、溶出時の混入を大幅に減らせる。Protein A/Gはタフなので、1回くらいlow pHに晒しても活性は維持している。 溶出はGlysine -HCl ~pH2.5 0.05%tween20で行う。

(無題) 削除/引用 No.8345-16 - 2019/10/24 (木) 08:53:52 - Tlueblot おおさん、なるほど！ ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.8345-15 - 2019/10/24 (木) 08:10:53 - おお >けれど、これはTrueblotに限らず、通常の免疫沈降時にもプロテインA/Gを使えば問題になるような気がしています... 程度はそれぞれで違うと思いますが他の系でも問題になることがあるような気がしてます。だから極端な変性条件をさけて薄いSDSで溶出するように改良してきました。ただし、Protein A/Gが混じっていたとしても一度完全に変性していますので従来ほどのIgG結合活性があるわけではないとおもいます。Trueblot、抗ラビットIgGの場合はおそらくProteinGやAを抗原認識部位で認識しているのかもしれません。膜上で非常にNative IgGににた構造を取りやすいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8345-14 - 2019/10/24 (木) 07:11:18 - Tlueblot mozさん、おおさん、 ＞ビーズから溶出する際に極極微量ですがプロテインA/Gも外れサンプルに混入します。これがブロット膜上で再生・Tlueblot抗体に結合 ありがとうございます！ けれど、これはTrueblotに限らず、通常の免疫沈降時にもプロテインA/Gを使えば問題になるような気がしています... このフォーラムのこのトピックでもご指摘いただきましたし、私の同僚からも指摘がありましたが、Trueblotの抗マウス抗体はProteinA／Gとは相性に問題ないようです。なぜなんでしょうね。 けれど私の問題はまずバックグラウンドを減らすことですね！ 早速しっかりブロッキングしてから行なってみます！ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.8345-13 - 2019/10/24 (木) 03:55:48 - おお >にしても、ロックランドのホームページにはTrueblotはプロテインA/Gでプルダウンしないで、 https://rockland-inc.com/Product.aspx?id=42150 ホームページのカタログではProtein AやGをつかったIPの例が示されていますが、理由はわかりませんが確かにExtraのバンドが見られてますね。ビーズから外れたProtein AやG（たぶんIP中にプロテアーゼなどのアタックとか、ボイルや強すぎる遠心などで壊れたアガロースから）と強い反応を示すのかもしれませんね。 私はお試し程度で使ったことはありますがそれほどひどい印象はないですけど、、、記憶が曖昧なのではっきりと言うことはできません。

(無題) 削除/引用 No.8345-12 - 2019/10/24 (木) 03:22:53 - moz ＞TrueblotはプロテインA/Gでプルダウンしないで、 ビーズから溶出する際に極極微量ですがプロテインA/Gも外れサンプルに混入します（医薬用抗体の精製では問題になる）。 これがブロット膜上で再生・Tlueblot抗体に結合し、予期せぬバンドとして検出されることがあるからだと思います。

(無題) 削除/引用 No.8345-11 - 2019/10/24 (木) 02:50:01 - Tlueblot おおさん、ありがとうございます！ はい、PVDF膜で行なっています。 ＞RIPAはその他のデタージェントが入っているのでSDSの強い変性作用はマスクされています。 なるほど！メイスセンスです！ ＞SDSは単独で強い蛋白変性剤ですのでかなりのタンパク質が失活したりします。抗体はビーズに残ったままと言いたいところですが１００％残るとまではいきませんが、抗体のバンドはより弱くなり目的のバンドが見やすいです。２回ぐらい懸濁、し上清を回収するといいかと思います。SDSは低温で沈殿する傾向がありますので、室温でやることになるでしょう。回収後はサンプルバッファー等で処理してから泳動ということになります。 ありがとうございます！試してみます！ ＞また以下のような溶出方法も発表されています https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0018218 みてみましたが、やはり半分くらいのIgGはそれでも溶出されていますね... にしても、ロックランドのホームページにはTrueblotはプロテインA/Gでプルダウンしないで、と書かれてありますが、それはなぜなんでしょうか...？おおさん、お察しつきますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8345-10 - 2019/10/24 (木) 01:52:45 - おお バックが高いということなのでブロッキング剤も試行錯誤したほうがいいかもしれません膜はNCですかPVDFですか？

(無題) 削除/引用 No.8345-9 - 2019/10/24 (木) 01:50:38 - おお >0.1％SDSって、それってRIPAバッファーもそうではありませんか？ >0.1％ SDS、100 mM Tris (pH5)を洗浄後のビーズに加えると抗体はビーズに残ったままで、抗体から認識タンパク質が溶出する、ということでしょうか？ RIPAはその他のデタージェントが入っているのでSDSの強い変性作用はマスクされています。 SDSは単独で強い蛋白変性剤ですのでかなりのタンパク質が失活したりします。抗体はビーズに残ったままと言いたいところですが１００％残るとまではいきませんが、抗体のバンドはより弱くなり目的のバンドが見やすいです。２回ぐらい懸濁、し上清を回収するといいかと思います。SDSは低温で沈殿する傾向がありますので、室温でやることになるでしょう。回収後はサンプルバッファー等で処理してから泳動ということになります。 また以下のような溶出方法も発表されています https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0018218 上記のことはTrueblotについてというよりA/Gビーズを使ったとき全般にという事です。 ＞0.1％ SDS、100 mM Tris (pH5) TrisはpH５は守備範囲ではないのでNaAcetateあたりでいいんじゃないかと。もしバッファーがPAGEを乱す傾向があると思えるならGlycineでpH５あたり（じつはGlycineも５は守備範囲でないけど）に合わす方がいいかなと。

(無題) 削除/引用 No.8345-8 - 2019/10/24 (木) 01:21:05 - Tlueblot おおさん、すみません！ 質問お願いします！ 0.1％SDSって、それってRIPAバッファーもそうではありませんか？ 免疫沈降時の洗浄は通常RIPAバッファーで行なっていますが、おおさんのアドバイスが正しいなら0.1％SDSで抗体から認識タンパク質が乖離してしまうと思うのですが...？

(無題) 削除/引用 No.8345-7 - 2019/10/23 (水) 13:01:03 - Trueblot asan様、 ありがとうございます。 実は同僚も抗マウス抗体のTrueblotはprotein A/Gと相性がいいみたいです。 うさぎではうまくいかなかったので抗ウサギ抗体ビーズでプルダウンした、と言っていました。 > 個人的にはheavy chain またはlight chain 特異的HRP抗体でしっかりblotした方が確実なのでどうしても被りそうなケースは結局そっちでやってました。 ということはHRP-抗heavy chain抗体を使われたということでしょうか？ これはIPに使用した抗体も認識されてしまわないでしょうか？ HRP-protein A/GならTrueblotと同じような働きをするかな？と考え、行ってみましたが、残念ながら IPに使用した抗体のheavy and light chainsは認識されてしまいました。

(無題) 削除/引用 No.8345-6 - 2019/10/23 (水) 12:57:40 - Tlueblot 皆さま、早速書き込みをしていただき、ありがとうございます。 本当に行き詰まっていたので、嬉しいです。 あと、Tlueblotではなく、Trueblotでした。すみません。 み様、ありがとうございます。 IPに使用したものも検出されてしまうんですね。。還元剤やSDS処理が不完全というのが理由なのでしょうか？ 私もそういうことがあるのかなぁと考え、フレッシュな還元剤を使用しました。 おお様、ありがとうございます。 そうですね、膜全体が黒くなるので、やはりブロッキングの問題ですね。 同僚から、5%スキムミルクで2時間はブロッキングすべきだ、とアドバイスをいただきましたので、それで行うことにします。そして次回は5000倍でまずは行ってみます。 ＞ 必死になって直接抗体についた蛋白を剥がさなくてもいいという理屈です。そうすると、０.１％ SDSで そうですねぇpH５ぐらいのバッファーでいいのかなぁってきがします、ボイルも必要ないでしょう。わたしはいままで０.１％ SDS、１００mM Tris （pHは合わしてない）をつかったりしてました。でもpH８以上だと理論的にはA/Gビーズから抗体が外れる条件なので。 ということはおお様も抗うさぎTrueblotを使用した時にはProtein A/Gでは問題が起きていた、ということでしょうか？素朴な疑問で、なぜ抗うさぎTrueblotとProtein A/Gは相性が悪いのでしょうか・・？ 0.1％ SDS、100 mM Tris (pH5)を洗浄後のビーズに加えると抗体はビーズに残ったままで、抗体から認識タンパク質が溶出する、ということでしょうか？ そういった方法があるんですね・・・ボイルはせずとのことですが、溶出後にボイルをすればいいんですね。

(無題) 削除/引用 No.8345-5 - 2019/10/23 (水) 10:59:42 - おお ooは「おお」です

(無題) 削除/引用 No.8345-4 - 2019/10/23 (水) 10:58:23 - asan ラビットの場合はバックが出てうまくいかないことはあるみたいですねー。 マウスモノクロのIPの時はうまく行きますよ。 ただ、確かにS/Nの問題なので多少はheavy chain light chain出てくる気もします。 Trueblotは何らかの方法で非変性igGを選択的に検出できる抗体を作製または濃縮してるものだと個人的には思ってますが、結局100%っていかないんでしょう。 個人的にはheavy chain またはlight chain 特異的HRP抗体でしっかりblotした方が確実なのでどうしても被りそうなケースは結局そっちでやってました。2nd antibodyなので少量ならそんなに高くないと思いますよ。Santa とかならサンプル頼めば確認ぐらいできるのでは？

(無題) 削除/引用 No.8345-3 - 2019/10/23 (水) 10:58:13 - oo 真っ黒っと言うことはIPの問題というよりブロッキングが効いていないとかそういう問題と思えるのですがどうでしょうか。 ＞Tlueblotは指示通り1000倍希釈 検出方法、ケミルミキットの感度で大きくかわると通常の２次抗体ではつくづくおもいます。感度のいいシステムを使っているなら１００００倍から５００００倍でもいいのではないかと思ったりします。 ＞プロテインA/Gビーズを加え、さらに一時間回転させたものを洗浄し、新鮮な還元剤を加えたSDSサンプルバッファーを加え、ボイルをしています。 抗体を剥がしてしまわなくてもいいし、抗体に直接結合した蛋白も効率的に溶出する必要もないです。そのタンパク質に結合した蛋白が剥がれればいいので、必死になって直接抗体についた蛋白を剥がさなくてもいいという理屈です。そうすると、０.１％ SDSで そうですねぇpH５ぐらいのバッファーでいいのかなぁってきがします、ボイルも必要ないでしょう。わたしはいままで０.１％ SDS、１００mM Tris （pHは合わしてない）をつかったりしてました。でもpH８以上だと理論的にはA/Gビーズから抗体が外れる条件なので。

(無題) 削除/引用 No.8345-2 - 2019/10/23 (水) 10:28:21 - み 通常プロトコールでは専用のIP-beadsと併せて使用するものでしょう。 以前に使用していたけどworkしてたよ。 Trueblot二次抗体を作用させるときBlocking buffer使ってたっけな。 高価だから2000倍希釈で使用してた。 でも本当にHeavy chainとLight chainが全くでないわけではなく、出にくくなるという感じ。 所詮S/N比の問題だからノイズより見たいバンドがしっかり出てくれれば良いだけだよね。 https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/rkl-20121225.asp?entry_id=10334

Tlueblotの使い方について 削除/引用 No.8345-1 - 2019/10/23 (水) 08:17:15 - Tlueblot ロックランドからTlueblotのHRP抗ウサギ抗体を購入しました。 しかし、中々結果が出ず、苦戦しております。 直面している問題はバックグランドが高すぎることです。 具体的な実験としては、マウス由来の細胞のライセートからウサギのポリクロを用いて4度で免疫沈降します。 その後、プロテインA/Gビーズを加え、さらに一時間回転させたものを洗浄し、新鮮な還元剤を加えたSDSサンプルバッファーを加え、ボイルをしています。 Tlueblotは指示通り1000倍希釈しています。希釈液はいつもウエスタンを行うように5％スキムミルク/TBSTです。1時間室温で反応させたのち洗浄しています。 結果は述べた通り、真っ黒です。Tlueblotの2000倍希釈でも同様の結果でした。 今、ロックランドのホームページを見たところ、あることに気が付きました。 rockland-inc.com/Product.aspx?id=42150 Protein A or G should not be used for the immunoprecipitation. Use of protein A or G beads with the rabbit TrueBlot will result in contaminating bands. For immunoprecipitation Anti-Rat IgG beads or Anti-Rabbit IgG beads should be used for rat or rabbit immunoprecipitating antibodies respectively. プロテインA/Gビーズを使ってはならぬ、とのことでした。抗ウサギ抗体のついたビーズでプルダウンするように。さもなくば、バックが高くなりそうだと書かれてあります。 今まで気がつきませんでした。 みな様もそうされていますでしょうか？ また、Tlueblotで綺麗なバンドを出すのはかなり難しい印象です。 Tlueblotキットなるものも売られています。その中にはブロッキング剤などが含まれていました。 情報をシェアしていただけると幸いです。

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