BioTechnicalフォーラム [30アミノ酸ほどのタンパク質の局在を追跡]

30アミノ酸ほどのタンパク質の局在を追跡

No.8359-TOPIC - 2019/10/31 (木) 02:03:27 - 30アミノ酸

お世話になります。
とある1型膜貫通タンパク質（全長で1500アミノ酸ほど）に興味を持っていますが、その細胞質ドメインは30アミノ酸ほどしかありません。そのドメインに機能的なドメインがあると仮定して、HAタグなどを誘導させ、細胞に発現させ、免疫染色で局在を同定したいです。

私自身、そのような短いペプチドを細胞に一過性に発現させ、染色したことはありませんが、うまくいくようなものでしょうか？何か特段気をつけることはありますでしょうか？
私はルーチンにGFP、myc、HA付きのタンパク質をCOS7に発現させ、染色はしています。
一抹の不安を覚えましたので質問させていただきました。
　

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No.8359-5 - 2019/10/31 (木) 17:41:07 - toto

タグの影響が一番懸念されるので、いくつか試してみてになると思いますが、可能ではあります。固定は、グリオキサールを使うのが安心かと思います。PFAと違って一分子で直接架橋でき、グルタルアルデヒドほどバックグランド蛍光や抗体反応性の低下に悩まされることは少ないようです。廃棄の手間も要らないので、最近ではPFAからこちらに乗り換えました。
The EMBO Journal Vol 37 | No 1 | 2018 139
にあります。

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No.8359-4 - 2019/10/31 (木) 12:52:42 - dcfvgyhu

膜タンパク質の一部ならば、普通に膜に局在していると思うのですが。当該タンパク質あるいはその細胞内ドメインが切断されたものは細胞質や核などに移行することがあるので、ということでしょうか。当該タンパク質の詳細がわからないので推察しかできないのですが、実験自体の難易よりも、目的と根本的な実験デザインの妥当性について、あいていどの経験と一定の能力のある人に相談した方が良いような気がいたしました。

細胞質領域に機能ドメインの存在を想定されているならば、局在みてもわかることは多くないと思うし、すぐできることとしてまずは当該タンパク質を発現していない細胞に、そのドメインを欠く当該タンパク質変異体を発現させてみるとか考えますが。

(無題)

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No.8359-3 - 2019/10/31 (木) 10:12:59 - み

全長型は普通は細胞膜に局在して機能するものですよね。
細胞内ドメインのみを発現させたら細胞質 and/or核内で観察できるでしょう。
細胞内ドメインが限定分解されるとかendogenousの現象が確認されていれば細胞内ドメインだけの局在を検討する意味はあるでしょうが、それが無かったら何だかなあと思うのは僕だけ？
相互作用蛋白との関係を見るとかで欠損変異体を作製することはよくあるだろうけど。

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No.8359-2 - 2019/10/31 (木) 06:47:30 - おお

全長にTagを入れて染色しない理由があるのですか？

１６アミノ酸のペプチドも染色したりしているようです。
https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S1550413118303905?token=D0E21700028318AEF871F89EA0109E2A25F06A409DC54C1537735C460DC001414B37D5B17BE076A480B077A60742C47E

小さいので固定されにくい可能性があると思う。固定時間など少し検討が必要かもしれない。グルタルアルデヒドをPFAに混ぜるか、単独で使うかとかするといいのかな。

30アミノ酸ほどのタンパク質の局在を追跡

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No.8359-1 - 2019/10/31 (木) 02:03:27 - 30アミノ酸

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