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相同組換えで遺伝子破壊2(シングルクロスオーバーの場合) トピック削除
No.840-TOPIC - 2012/08/15 (水) 22:37:27 - 初心者
先に、ダブルクロスオーバー組換えのことも質問させて頂きました。長くなりますので、新たに投稿いしました。よろしくお願いします。
シングルクロスオーバー組換えで遺伝子ノックアウトを行う場合、
選択マーカーや標的遺伝子ORFを組み込んだプラスミドは、リニアにするのと環状のままでは、どちらが良いのでしょうか。
どちらでも構わないし、環状で使用した場合は、ORFのちょうど半分くらいの位置前後で、プラスミドに組み込んだORF⇔宿主のORF組換えが起こるとも言われました。
組換えの起こる位置は 大抵どんな宿主でもORF中間部(たとえば1KbのORFなら500bp付近)と決まっているのでしょうか?そのあたりのメカニズムを勉強中ですが、いまいち核心に触れられません。
 
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(無題) 削除/引用
No.840-4 - 2012/08/19 (日) 10:42:08 - 中年
もう一方のトピックにも書きましたが、DNA断端がrecombinogenicなので、ORF内で切断するほうが効率が高いでしょう。

環状のプラスミドでORFの中央付近で組換えが起こりやすくなる理由はないでしょう。マーカー遺伝子が宿主由来のもの(酵母ならURA3やLEU2のような)であれば、そちらで組換えが起こることも同様に起こります。

酵母と細菌です 削除/引用
No.840-3 - 2012/08/17 (金) 22:53:01 - 初心者
中年様、ありがとうございます。生物種を記載していませんでした。宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.840-2 - 2012/08/15 (水) 23:09:04 - 中年
どの生物種の話でしょうか?

相同組換えで遺伝子破壊2(シングルクロスオーバーの場合) 削除/引用
No.840-1 - 2012/08/15 (水) 22:37:27 - 初心者
先に、ダブルクロスオーバー組換えのことも質問させて頂きました。長くなりますので、新たに投稿いしました。よろしくお願いします。
シングルクロスオーバー組換えで遺伝子ノックアウトを行う場合、
選択マーカーや標的遺伝子ORFを組み込んだプラスミドは、リニアにするのと環状のままでは、どちらが良いのでしょうか。
どちらでも構わないし、環状で使用した場合は、ORFのちょうど半分くらいの位置前後で、プラスミドに組み込んだORF⇔宿主のORF組換えが起こるとも言われました。
組換えの起こる位置は 大抵どんな宿主でもORF中間部(たとえば1KbのORFなら500bp付近)と決まっているのでしょうか?そのあたりのメカニズムを勉強中ですが、いまいち核心に触れられません。

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