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(無題) 削除/引用 No.842-9 - 2012/08/21 (火) 15:17:23 - cut my hair 色々なご指摘有り難うございました。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.842-8 - 2012/08/19 (日) 07:26:28 - ~ 手間とコストを節約するのは非常に当然だと思います。 サザンだと、1日でゲノム精製から結果まで、というわけにも行きませんし 多くの場合Cre-TgマウスはCreの有無だけで区別されれば問題ないと思います。 もちろん挿入部位次第なので、ホモにしても変化がないことを確認してからにはなりますが。 「Cre-Tgマウスのホモ/ヘテロを見分ける方法」とのご質問ですので、 一番ベーシックなのはサザンかなぁ、と思いましたが、 実際私自身、Cre-Tgマウスのホモとヘテロを区別することなく使用しております。

確かに 削除/引用 No.842-7 - 2012/08/17 (金) 21:29:14 - DrCarter 真面目にサイエンスするならサザンでしたね。 以前Double-Creマウスを扱ってたときに、片方のCreの配列が不明で、ひたすらサザンでgenotypingをしていたことを思い出しました。 掛け合わせるしかないでしょうなんて、恥ずかしいことを言ってしまいました。 でもやっぱり自分だったら掛け合わせるだけで確かめてしまうでしょうね。 購入したマウスのgenotypingでサザンというのは手間かかりすぎのような気がしますし、万が一のことがあっても、Cre/CreとCre/WTの差はほとんどない（という認識なのですがどうなのでしょう？）と思いますので。

(無題) 削除/引用 No.842-6 - 2012/08/17 (金) 19:57:20 - ~ サザンをしてみてはいかがでしょうか？ 元々、トランスジェニックマウスを作製する際には挿入されたコピー数を知るためにやられているはずですし、 当然片側アリルか両側かの違いも検出できるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.842-5 - 2012/08/17 (金) 11:45:17 - PCR TaKaRaの資料で昔見たことがありますが、TaqManでもSNIPのホモ／ ヘテロ判別の用例が出ています。 単純にSYBR Greenの系でも、増幅率が100%に近いプライマーセットを使えば、ホモとヘテロが2:1に近い割合で分けられるようです。 内部標準として、細胞がオス由来ならY染色体の遺伝子（1コピー）と普通のゲノム上の遺伝子（2コピー）を使います。 試しでやってみたこともありますが、ゲノムの精製度が悪くて、なんとなく違う、程度の結果しかでなかったのですが、ちゃんとゲノムを精製してプライマーを吟味すれば原理的には上手くいくはずです。 今ちょっと資料が見つからないのですが、探してみます。

(無題) 削除/引用 No.842-4 - 2012/08/17 (金) 08:31:48 - cut+my+hair >DrCarter 有り難うございました。 よくわかりました。 >PCR ホモかへテロかqPCRで見分けられるのに興味を持ちました。 transgene内部にprimerを設計してqPCRを行えば、PCR productの量がヘテロに比べてホモだと２倍になるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.842-3 - 2012/08/17 (金) 07:26:44 - PCR 相同組換えでなければ挿入箇所がランダムで、普通はどこに挿入されているとか調べていないというのは、すでに指摘されている通りだと思います。 ホモかヘテロかは、qPCRで調べることもできます。 この場合は、よいprimerを設計できるかにかかっています。

おそらく 削除/引用 No.842-2 - 2012/08/17 (金) 06:38:43 - DrCarter PCRで判別できないということは、X-Creの配列が相同組換えでX遺伝子に置き換えられているのではなく、ランダムに挿入されているのでしょう。ゲノムのどこに入っているか分からないので、insertionしている部位の外側でPrimerを設定することができないのだと思います。 その場合、判別する方法としては、Wildのマウスと掛け合わせるしかないでしょうね。何回掛け合わせてもTgマウスしか生まれないなら、親はTg/Tg、大体半々で産まれてくるなら、Tg/+です。そうやってオスとメスのTg/Tgを別々に同定できれば、あとはそれらを掛け合わせればずっとTg/Tgのみが産まれるようになるので、genotypingしなくて良くなります。（たまにした方が何となく安心ですけどね。知り合いでgenotypingをサボっていたら、いつの間にかWTに戻っていて、1年分の実験がおしゃかになった人がいます。）

Cre TgマウスのHEとHOを見分ける方法って？ 削除/引用 No.842-1 - 2012/08/17 (金) 02:51:17 - cut my hair Jacksonで販売されているあるCreのtransgenic miceを使っています。jacksonのgenotyping protocolを見ると、 This assay will NOT distinguish hemizygous from homozygous transgenic animals. と記載してあります。つまりCre +/+ とCre Tg/+ (or TG/TG)は見分けられるけど、Tg/+とTg/Tgは見分けられないということです。 なんとなく今まではTransgeneの内側でprimerを設定しているから、Transgeneがheteroでもhomoでも存在さえすれば、そのPCR productが出来てしまって見分けれないのだと理解していました。しかしそれなら、そのtransgeneがinsertionしている部位の外側にPrimerを設計すれば、WTかHeterozygoteの場合にはWT alleleを認識してPCRがかかって、Homozygoteの場合には両方のalleleにtransgeneが入っているからPCRがかからないというような系が作れそうな気がしました。この考えは間違っているのでしょうか。なにぶん知ろうと考えなのでよくわかっておりませんが、詳しい先生方からご助言をいただけますと助かります。よろしくお願いいたします。

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