皆様
大変参考になります。使用しているベクターはpSP73でamp耐性です。
皆様に指摘されて、思い出したのですが、今使っているグリセロールストック自体が、比較的長時間培養したサンプルから回収した覚えがあります。
もしかすると、その時点ですでにβラクタマーゼでAmpが不活化されて、チューブ内に耐性のないE.coli増えて多量に含まれているのかもしれないと思いました。
そう考えるとそこから、直接、菌塊を取って、前培養、本培養と持って行っても、βラクタマーゼが持ち込まれ、ampが不活化され、一緒に非耐性菌も増えて、計を大きくして行っても、その繰り返し、という感じになっているのかもしれないと考えましたが、ありえることでしょうか?
まとめると
1)グリセロールストックから菌塊をLB-ampに一度懸濁して、プレート培養して、そこからコロニーを選択して培養を開始する
2)前培養するのであれば、一度遠心して、新しいLB-ampで洗浄してから本培養に行く
3)むしろ前培養なしでコロニーから、直接、本培養に行くのもあり
という感じでしょうか。
ちなみに濁度はどのくらいで止めるのが適切なのでしょう?
菌種によって差はあるかと思いますが、
本フォーラムの過去の記事などをみると0.5が適切と書いてあったりもします。
ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1286
上記事は対数増殖期に集菌をする前提で書かれているように思うので
プラスミドの収量を上げるということを考えるなら、AP様のおっしゃるように3前後で定常期で回収、というのが適切でしょうか?
濁度が高すぎると、非耐性菌が増えてしまうのではないかという心配があったもので。
ご教示いただけますでしょうか。 |
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