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(無題) 削除/引用 No.8427-2 - 2019/11/20 (水) 10:06:53 - asan iPSやES細胞ならknock in 効率が非常に高いのでそんなことをいった論文も出てます。 故に疾患特異的変異を出すためにヘテロをとるために1:1でWT, MUTのdonorを入れて行うといった方法が取られてたりもします。 がん細胞の場合そもそも染色体数が2本出ないことも多いので、100% ホモknock in をとるのは結構大変です。 仮にgRNAにリターゲットされてknock in が取れないなら、ほぼ100%のクローンで編集がおきてると思いますがそんなことはないケースが多いです。knock in の効率を何で評価してるのかにもよりますが、リターゲットされても目的の変異は残ってるならそれを指標にPCRなりRFLPの検出では変異の挿入が確認できるのではないでしょうか。

ノックイン（MMEJ）に関して 削除/引用 No.8427-1 - 2019/11/20 (水) 01:44:28 - ノックイン（MMEJ）に関して 質問させてください。 今、ノックインの実験を培養細胞で行なっていますが、その際のテンプレートが正しくノックインされた際に、gRNAの標的配列が再び回復してしまうことに気が付きました。 これまでノックイン体が一つも取れず、コンストラクトを見直していたら気が付きました。 もちろんこれがノックイン体が取れない大きな理由にはなっているかと思いますし、今後速やかにテンプレートにsynonimous変異を持たせたコンストラクトを作り直すつもりです。 一方、それをしたところで0だったコロニーが10ないし100出現するというのも考えにくいかとも思っています。今は293Tへのノックインを試していますが、トランスフェクション効率は100％近くですし、テンプレートにたとえgRNAの標的配列が含まれていたとしても効率はうんと悪くはなるかと思いますが、それでも1つくらいはそんなコロニーが取れてもいいのでは...と考えています... ご意見を聞かせてくださると幸いです。 よろしくお願いいたします。

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