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ライゲーションが上手くいきません トピック削除
No.8431-TOPIC - 2019/11/21 (木) 04:28:22 - 助けて欲しいです
nebのt4 dna ligaseを用いてかれこれ2週間トライしてますが、クローニングできません。

3kb のPCR産物のクローニングはいくつかコロニーを拾いようやく取れましたが、最近やってる70bpほどのオリゴの挿入なんてちっともです…

オリゴはすでにxba1切断してあるかのような末端をしてます。
リン酸化もしてます。ベクターはxba1カットして脱リンしてます。

今気づいたんですが、25°でライゲーション推奨で、通常のt4 dna ligaseは熱失活しやすいみたいで、もしかしたら私はこれまでずっと37度で2時間ほどしてきましたが、その間に失活してしまったかと危惧しています…やはりそういうことでしょうか…
 
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(無題) 削除/引用
No.8431-24 - 2019/11/23 (土) 20:11:24 - 雑談人
直接の回答ではなくて申し訳ありません。

in fusion酵素もリガーゼも使用しない面白いクローニング法を見つけました。

AQUA Cloning: A Versatile and Simple Enzyme-Free Cloning Approach
Published: September 11, 2015
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137652

このような手法があることも知っておくと、役立つかもしれません。


SliCEクローニングも良いと思います。
http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/~motohas/motohashi_lab/oyakudachi_others_SLiCE.html

(無題) 削除/引用
No.8431-23 - 2019/11/23 (土) 11:09:01 - 助けてほしいです
kakiさん、ありがとうございますm(_ _)m

ごめんなさい、PNK bufferにATPが含まれていないことを知りませんでした。
以下が組成です。

1X Buffer Components
70 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
5 mM DTT
pH 7.6@25°C

やってしまいました・・・これが原因でしょうね・・・

とても助かりました。明日、もう一度チャレンジしてみます。
みなさま、稚拙なトピックにも関わらず親切丁寧にご指導いただき、心から感謝しています。

(無題) 削除/引用
No.8431-22 - 2019/11/23 (土) 09:36:12 - kaki
リン酸化でATPは入れてますか?
私が使っているTaKaRaの酵素ではATPを別に追加する必要があります。

(無題) 削除/引用
No.8431-21 - 2019/11/23 (土) 04:58:11 - 助けて欲しいです
37度でもそれほど問題なくラーゲーションはできるのですね...

あと、オリゴは別々のリン酸化ではなく、一緒くたにしてリン酸化させています。
リン酸化させないでクローニングする方法なんてあるんですね...セルフライゲーション産物がたくさんそれてきそうで不安です。ただリン酸化もせずベクターも脱リン酸化もしないとなれば時短はできますね。

pcDNA3.1(+)なので、Xba1サイトはメチル化されていないと思います。
ただ、メチル化で影響を受けるとは知りませんでしたので、勉強になりました。

>そもそも切れてるか切れてないかはこの時点で電気泳動したら一目瞭然。
はい、電気泳動でXba1有無で流したところ明確にバンドのシフトが見られたのでベクター側は切断はされていそうです。

>取れないというのが、コロニーが生えてこない、異常に少ないのか、生えてくるけど空ばっかりなのか?
生えては来ますが、空ばかりです。オリゴ有無ではコロニー数に違いはありません。

>ライゲーションではなくインサートポジティブクローンの確認法に問題がありませんか。
コロニーPCRもしくは、ミニプレップでシークエンシングしています。


昨晩のオリゴだけでのライゲーションが全く上手く行っていないので、おそらく何かがおかしいのだと思います...

(無題) 削除/引用
No.8431-20 - 2019/11/23 (土) 04:37:19 - 助けて欲しいです
みなさん、この度は本当にありがとうございますm(__)m
またみなさんからのコメントに応えるために追加実験をしていたところかなり時間が空いてしまいました。ごめんなさい。

今回、ライゲースを新しくし、コンピテントセルもきちんとワークすることを別のプラスミドで確認し、また、クローニングの確認はコロニーPCRでこれまでのクローニング同様行なっていますが、今回はコロニーPCRがうまくいかなかったので、数個コロニーをピックし、シークエンスを読みました。すべてオリジナルのpcDNA3.1+が検出されただけでした。

そして、コメントいただきましたように、オリゴだけにバッファーとT4ライゲースを加えて、オーバーナイト4度でライゲーションしてみたものを1%アガロースゲル電気泳動でチェックしてみました。
すると...70bpほどに一本あるだけで、オリゴマライズされたものはまったく検出できませんでした...

問題は少なくとも2点あります。
一つはオリゴなしでライゲーションしたものでもたくさん(20-200個ほど)のコロニーがでてしまうこと(Xba1未消化体か、CIPによる脱リン酸化が効いていない)。
もう一つは、オリゴがオリゴマライズされていないことです。

以下が今回アニールして、pcDNA3.1+のXba1サイトにクローニングしたい配列です。


3xFLAGFwdXba1:
5’-ctagaGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGTAGT-3'

3xFLAGRevXba1:
5'-CTAGACTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCT-3'

配列は3xFLAg配列の最後にストップコドンを持たせ、両端にXba1で切断された後のかたちを再現したものです。

このオリゴ(100uMストック溶液)を1 ulずつ取り、そこへ水6 ul加え、PNKバッファー1 ul、PNK 1 ul加え、37度、30分放置したのち、95度で5分、それ以降は5度ずつ25度になるまで1分間隔で下げていきます。

これでなぜアニールしたオリゴのオリゴマライズがうまくいかないのでしょうか?
お助けください...

(無題) 削除/引用
No.8431-19 - 2019/11/22 (金) 10:34:51 - AP
>3kb のPCR産物のクローニングはいくつかコロニーを拾いようやく取れましたが、最近やってる70bpほどのオリゴの挿入なんてちっともです…

取れないというのが、コロニーが生えてこない、異常に少ないのか、生えてくるけど空ばっかりなのか?

(無題) 削除/引用
No.8431-18 - 2019/11/22 (金) 10:17:23 - moz
投稿主さんに初歩的な質問で申し訳ないですが、ライゲーションではなくインサートポジティブクローンの確認法に問題がありませんか。
例えば、青白選択ですか(読み枠によっては青くなる:逆向きなら白色コロニーになりそうですが)、
PCRですか、
MiniprepしてXbaI切断ですか(damメチル化が問題なるかもしれないし、挿入断片がEtBr染色で視認出来る程度のゲル濃度・DNA量を切断しているか)、
あるいは挿入断片内を切断する制限酵素をお使いですか?

(無題) 削除/引用
No.8431-17 - 2019/11/22 (金) 10:14:40 - AP
>ベクターはxba1カットして脱リンしてます。

そもそも切れてるか切れてないかはこの時点で電気泳動したら一目瞭然。

(無題) 削除/引用
No.8431-16 - 2019/11/22 (金) 10:13:12 - AP
大腸菌で増やしたDNAでメチル化が問題になるのは
dam methylation GmATC
dcm methylation CmCWGG
で、この認識配列が制限酵素の認識配列とオーバーラップするときに、制限酵素が効かなくなるという問題がでるわけです。

XbaIの場合、問題になるのはdamですが、XbaI認識配列にdam認識配列が内包されるわけではなく、隣にTCが並んだ場合に、tata[gaTC]とカッコ内が認識配列となってメチル化されます。
XbaI認識配列ならdam認識配列を構成しない場合でも、ちょっとは影響受けるというものでもありません。またdam認識配列構成していても、ちょっとはメチル化を免れれて切断可能な分子があるということも無いようです(電気泳動で見て判断する限り)。

ベクターのクローニングサイトは切ることが切ることが前提ですから、そういう配列には設計されていません。

(無題) 削除/引用
No.8431-14 - 2019/11/22 (金) 09:51:57 - ちき
GM48やJM110のような古典的なdam dcm株はrecA+だったり、endA+だったりしてtrickyなところがあるので、使う際には注意。コンピテンシーも低いです。(C2925はendA-なんですね。素晴らしい。)その前に、XbaIサイトがGATCとかぶっていないか確認するのが先ですが。

(無題) 削除/引用
No.8431-13 - 2019/11/22 (金) 08:37:24 - おお

FAQ: Is XbaI affected by methylation?
XbaI is blocked by overlapping dam methylation. If the XbaI recognition site is preceded by GA or followed by TC, the Dam methylase within most E. coli cloning strains will methylate the GATC site. For example, XbaI sites gaTˆCTAGA and TˆCTAGAtc will be blocked by methylation. To avoid dam methylation use a dam-deficient strain such as dam-/dcm- Competent E. coli (#C2925). For up-to-date information about methylation sensitivities, please visit Dam-Dcm and CpG Methylation or REBASE.

https://www.neb.com/faqs/0001/01/01/is-xbai-affected-by-methylation

(無題) 削除/引用
No.8431-12 - 2019/11/22 (金) 08:27:13 - たま
私と同じ状況です。私もXba1を両サイドに持たせた3xmycタグを両端が切断ベクターにライゲートされるようオリゴを工夫をして、Xba1で切断したpcDNA3.1+にクローニングしようとしていたことがあります。ただ、全くうまくいきませんでした。

>XbaIサイトはメチル化受ける場合があるので、個人的には使用しないようにしてます。
そのベクターのXbaIサイトはメチル化受けやすい配列ではないですか。

私はpcDNA3.1+を使っていますが、メチル化のことは知りませんでした。
それが理由になりますかね?

(無題) 削除/引用
No.8431-11 - 2019/11/21 (木) 20:51:30 - kaki
オリゴをアニールしてライゲーションよくやります。

まず、個別にリン酸化します。オリゴ濃度は5uM、10uLスケールです。T4PNKは0.1-0.2uL使います。

次に等量ずつ混ぜてアニールします(2.5 uM)。サーマルサイクラーを使い95Cから4Cまで20−30分かけてやってます。

それをTrisバッファーで50倍程度に薄め、インサート対ベクター比5-6程度でライゲーションしています。ベクターはもちろん脱リン酸しています。

(無題) 削除/引用
No.8431-10 - 2019/11/21 (木) 13:03:26 - TS
shRNAプラスミドを作るプロトコルがいろいろなところにあると思うので、それを参考にしたらどうでしょうね。
以前しばしばやってみましたけど難易度は高くないですよ。
問題なければ、オリゴをSticky endになるようにデザインして、アニーリングしてやれるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用
No.8431-9 - 2019/11/21 (木) 12:57:00 - 独り言
XbaIサイトはメチル化受ける場合があるので、個人的には使用しないようにしてます。

そのベクターのXbaIサイトはメチル化受けやすい配列ではないですか。

(無題) 削除/引用
No.8431-8 - 2019/11/21 (木) 12:39:34 - おお
昔にここでDiscussionしたことがあるのですが、オリゴなど小さいものならオリゴはリン酸化せず、ベクターはリン酸化したまま(脱リン酸、フォスファターゼ処理せずに)Ligationしている人がいました。オリゴを過剰にいれる(100倍とか)ことでインサートが入っている確率が上がるので、結構うまく行くという話でした。

(無題) 削除/引用
No.8431-7 - 2019/11/21 (木) 09:53:41 - AP
で、末端リン酸化二重鎖オリゴのライゲーションを37℃でやるとオリゴの重合が優位になりそう。ベクターに対するオリゴの比率も検討したほうが良さそうですね(比率をうんと下げる)。

(無題) 削除/引用
No.8431-6 - 2019/11/21 (木) 09:49:34 - AP
すでに出ていますが、ライゲーション反応を低温でやるのは分子内ライゲーションで自己環状化が起こりやすくなるようにするためだったはず。酵素反応自体は温度を上げたほうが(37℃)早く進みますが、分子間ライゲーションが優位になって重合化が起こりやすい。cDNAクローニングなどでDNA断片の末端にリンカーやアダプターを連結するときは分子間ライゲーションを狙っているので37℃でやったりします。リンカーやアダプターのライゲーションは平滑末端のライゲーションであるわけですが、平滑であるから温度を上げるというわけではありません。

ライブラリー作成のように多様なクローンを得る必要があるのではなく、単一のフラグメントのクローンが取れれば良いというのでなければ、室温で5-30分でライゲーションでいいというプロトコールなんかもありますね。

(無題) 削除/引用
No.8431-5 - 2019/11/21 (木) 09:07:01 - ちき
低い温度でライゲーションするのはcohesive endsのアニーリングのため、分子間の衝突のみが問題になるblunt endsの場合は37°Cという理屈も読んだことがあるのですが、どれが正しいんでしょうね。

(無題) 削除/引用
No.8431-4 - 2019/11/21 (木) 07:23:35 - moz
T4ファージも大腸菌に感染し増殖するので、T4 DNA Ligaseは37℃で直ぐに失活しませんよ。
37℃でのライゲーションは、環状化ではなく線状化(コンカテマー)形成に向いていると一昔前の実験書には書いてあった。
環状化には低温(16~22℃)〜室温反応が推奨されていますが、37℃反応で環状化できないわけではなく程度の問題です。私は面倒だから室温で放置することが多いですね。

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