BioTechnicalフォーラム [植物培養細胞の上清回収について]

植物培養細胞の上清回収について

No.8434-TOPIC - 2019/11/22 (金) 10:08:32 - あつま

現在, タバコ培養細胞 (BY-2 細胞) を用いて実験を行うことを考えているのですが細胞のサイズが大きいためか遠心分離して上清を回収しようとしても沈殿した細胞が舞い上がってしまい綺麗に上清を回収できません。一応細胞が沈殿はするのですが, ペレットにならずただ沈殿している状況になっています。遠心の時間を延ばしたり, 回転数を上げてみたもののあまり違いはありませんでした。
この場合どのように上清を分離すればよいのでしょうか？
　

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No.8434-9 - 2019/11/23 (土) 15:03:39 - ちき

振盪です(変換ミスではありません)。あくまでも酵母とGF/Aのフィルターを用いた場合であって、細胞が塊で簡単に外れれば液体中で振盪する必要はない訳です。

(無題)

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No.8434-8 - 2019/11/23 (土) 14:47:27 - あつま

SYBR MASTER 様ご意見ありがとうございます。ブフナーろ過での細胞回収も検討いたします。

ガラスフィルターを使用する場合はろ過後, 何かしらの溶液の中で浸透を行うのですか？

(無題)

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No.8434-7 - 2019/11/22 (金) 17:01:32 - SYBR master

ろ紙上にトラップした細胞は、マイクロスパーテルの平たい方で、つついてやれば、ぽろっと塊で取れます。

タバコ培養細胞は懸濁液の粘度が少し高めだったような気がしますが、BY-2細胞も確か同じ様に回収した記憶があります。

吸引なら1分も回収には時間が掛からないので、そのまま核酸抽出(DNA or RNA)、代謝産物抽出、タンパク質解析にそのまま利用できます。

(無題)

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No.8434-6 - 2019/11/22 (金) 15:02:18 - ちき

私の実験では、ろ過集菌した酵母細胞をパルスフィールド電気泳動用のプラグにしてました。適当なbufferに細胞がのったフィルター(25mm径のものを使ってました)を入れて、しばらく振盪すれば細胞ははずれてきます。

お使いの細胞が予定されている実験に問題のない程度にintactで回収できるかについては、ご確認ください。

(無題)

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No.8434-5 - 2019/11/22 (金) 12:43:45 - あつま

皆様貴重なご意見ありがとうございます。

私の実験系では細胞をバッファーなどで抽出して上清を使う場合と, MTT assay などで細胞本体を使用したい場合と両方あります。

上清を使用する場合はSYBR Master さんや tts さんのいうようにシリンジのフィルターやブフナーろ過でやってみたいと思います。

ガラスフィルターでろ過した場合, その後細胞の回収はできますか？

今考えている実験系では必ずしも無菌で行う必要はないです。

(無題)

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No.8434-4 - 2019/11/22 (金) 11:49:14 - SYBR master

ブフナー漏斗と吸引ビンで、植物の懸濁培養細胞回収してました。

ブフナーにWhatman NO1ろ紙(円形)をおいて、吸引しながら細胞をトラップ。吸引ビンに培養液が回収できます。

植物培養細胞の上清回収について

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No.8434-3 - 2019/11/22 (金) 11:14:09 - tts

培養上清が必要と言うことでしょうか？

私もあつまさんと同様に回収した上清を用いて実験しています。
使用している細胞は接着細胞で、適当なシリンジフィルターで培養上清を濾過してから実験に用いています。

(無題)

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No.8434-2 - 2019/11/22 (金) 10:50:27 - ちき

無菌的に行う必要がありますか。ガラスフィルターを使うのはだめでしょうか。酵母の集菌にWhatmanのGF/Aを使っていましたが。