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CCK-8 死細胞 トピック削除
No.8435-TOPIC - 2019/11/22 (金) 12:44:01 - ｈｓｔｒｓｈ
お聞きしたいことは，CCK-8やMTT等の生細胞数方法が，死細胞をどの程度カウントするのかということです．

生細胞数をCell counting kit-8で測定しました．MTT法を用いる予定でしたが，試薬量及びそこまで重要視していないデータなのでCCK-8を選択しました．
ただ，CCK-8により生細胞数の低下する傾向が得られたのですが，一部のデータでTUNELによりカウントされたアポトーシス細胞の数とは明らかに相違がありました．

ある程度のばらつきは仕方ないと思いますが，CCK-8のような酵素により測定する試薬は，死んでいる細胞（アポトーシスのように接着している細胞？）をカウントしてしまっているのではないかと感じました．

急遽細胞の実験をすることになり，細胞に関しての知識は皆無で申し訳ないのですが，細胞実験を日頃から行っている方から見て，死細胞がカウントされる可能性についてお考えになるでしょうか．



それから，これも初歩的で申し訳ないですが，細胞死（アポトーシス）が良くわかりません．
細胞について全く知らないもののイメージとしては，細胞死＝剥離なのですが，TUNELは接着している細胞を染色すると思います．これは細胞死の途中の細胞をTUNELでは測定しているということでしょうか．

宜しくお願いします．
　
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(無題) 削除/引用
No.8435-4 - 2019/11/23 (土) 11:26:25 - ちき
すみません、vital stainingとTUNELはcompatibleじゃないですね、訂正します。

(無題) 削除/引用
No.8435-3 - 2019/11/23 (土) 10:47:44 - ちき
MTTやCCK-8だと無理かもですが、何らかのvital fluorescent dyeで染色して、それとTUNELとの相関をFACSで見るなどの実験はすぐ可能だと思います。

以下は抽象的な答えで申し訳ないのですが、

ある現象を2とおりの指標で測定したとき、両者が一致しないのはごく普通のことに思えます。もちろん2つの指標が全く独立に変動していたら同じ現象を測っているという根拠がなくなるので、2つが一連の現象の違う時点を測っているのだろうとか、片方がもう片方を包含しているのだろうとか、片方はongoingな量でもう片方は積算量だとか解釈して(モデルを想定して)、辻褄が合うか確認する訳ですが。

それからアポトーシスの指標ですが、アポトーシスを起こした細胞は最終的にはいなくなるので、TUNELに限らずすべてのアポトーシス特異的指標は一過性(何かの途中を測っている)だと思います。

(無題) 削除/引用
No.8435-2 - 2019/11/23 (土) 04:30:54 - おお
CCK-8はNAD(P)Hの量を測ってますね。死んでもNAD(P)Hをまだ持っていれば数字を押し上げると思います。NAD(P)Hが多くなるかどうかはわかりませんが、代謝も乱れるでしょうし（もしかしたら詳しい人がいるかもしれませんけど）。
接着細胞の多くは細胞が死ぬと浮いてきます。そういう意味ではTunel染色で細胞死があったことは示せますが、定量的な話になると慎重に検討しないといけないかなとおもいます。
あまり根拠は示せませんが細胞死が起こった直後はDishについていても不思議ではないなと思えます。Programed cell deathも核に強く働きかける物があったり、細胞質や膜に強く働きかける物があるのかもしれませんし、同じDishの上でもここの細胞の状態（細胞のHeterogeneity)でも変わるのかもしれません。

https://academic.oup.com/nar/article/26/22/5233/1024182

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/%28SICI%291097-0320%2820000201%2939%3A2%3C141%3A%3AAID-CYTO7%3E3.0.CO%3B2-O

CCK-8 死細胞 削除/引用
No.8435-1 - 2019/11/22 (金) 12:44:01 - ｈｓｔｒｓｈ
お聞きしたいことは，CCK-8やMTT等の生細胞数方法が，死細胞をどの程度カウントするのかということです．

生細胞数をCell counting kit-8で測定しました．MTT法を用いる予定でしたが，試薬量及びそこまで重要視していないデータなのでCCK-8を選択しました．
ただ，CCK-8により生細胞数の低下する傾向が得られたのですが，一部のデータでTUNELによりカウントされたアポトーシス細胞の数とは明らかに相違がありました．

ある程度のばらつきは仕方ないと思いますが，CCK-8のような酵素により測定する試薬は，死んでいる細胞（アポトーシスのように接着している細胞？）をカウントしてしまっているのではないかと感じました．

急遽細胞の実験をすることになり，細胞に関しての知識は皆無で申し訳ないのですが，細胞実験を日頃から行っている方から見て，死細胞がカウントされる可能性についてお考えになるでしょうか．



それから，これも初歩的で申し訳ないですが，細胞死（アポトーシス）が良くわかりません．
細胞について全く知らないもののイメージとしては，細胞死＝剥離なのですが，TUNELは接着している細胞を染色すると思います．これは細胞死の途中の細胞をTUNELでは測定しているということでしょうか．

宜しくお願いします．
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