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(無題) 削除/引用 No.8440-6 - 2019/11/25 (月) 12:55:50 - おお ６Wellなら１５０uLはちょっと少なすぎないですか？５００uLくらいでいいのではとおもいますが。なので抽出もうまくいってないのかもしれません。 スクレーパーは探せば幅が小さいものがあります。 また、指摘がすでにあるようですがPhosphatase inhibitorsを加えたほうがよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8440-5 - 2019/11/25 (月) 11:18:31 - mp 横から質問なのですが、sample buffer中でbenzonaseって効きますか？１度試したことがあるのですが粘稠性が消えるところまではいきませんでした。Mgイオンなんかを加える必要があるのでしょうか？あるいはSDSの濃度を下げるとか？

(無題) 削除/引用 No.8440-4 - 2019/11/25 (月) 09:32:10 - moz WBするだけなら、直接SDSサンプルバッファーに溶解させるとかTCA溶液を加えるのが確実です。 免沈するなら、phosphatase Inhibitorとprotease inhibitorを加えるが定法でしょうか。 素早く回収＞次の処理（あるいは凍結保存等）が良いです。 このフォーラムで何度も議論されていますが、 Inhibitorは信用しすぎてはいけません。気休め程度に思っておいた方が無難です。氷冷も水を加えた氷の方が接触面積が広く効果的です（水没に注意）。底面に密着する金属プレート(on ice)も有効です。 6ウェルディッシュくらいの細胞量ならP200チップ等のpipettingでもDNAは剪断されませんか？ 私はズボラなのでbenzoneseに頼ることが多いです。 また何度もボイルすることもあまりお薦めしません。問題ないタンパクも多いですが、トラブルになる（結果が安定しない）タンパクもあるので注意してください。

(無題) 削除/引用 No.8440-3 - 2019/11/25 (月) 08:52:35 - 奈緒 mozさん、確かに血清フリーなので洗浄も二回する必要はなさそうですね！ ありがとうございます。 なるほど、p1000チップ！とっても参考になりました。 ぜひ次回から行ってみます！ もう一点お伺いしてもよろしいですか？ ライセートとサンプルバッファーを混和後、ソニケーション（1分x4セット）の前に先にボイルを行って確実にプロテアーゼやキナーゼなどを失活させておいた方がいいのでしょうか？ソニケーション後に改めてボイルをもう一度行えばもっと確実かと期待しています。

(無題) 削除/引用 No.8440-2 - 2019/11/25 (月) 08:21:12 - moz 細胞の洗浄は時にシグナルが細胞に入ります。 多めの氷冷洗浄液で洗浄回数を1回に減らしたりCa、Mgを添加したPBSやHBSS、あるいは無血清培地も良いかもしれませんし、その後の実験に問題がなければ洗わないとか（RNA調製では良く行う）。 ディッシュを30秒ほど傾けておくとほとんどの残液を吸引除去出来ます（乾燥に注意）。 また、スクレーパーの代わりにP1000チップを逆向きに使うと良いですよ。

細胞の刺激方法とライセート回収方法 削除/引用 No.8440-1 - 2019/11/25 (月) 07:59:01 - 奈緒 お知恵を拝借させてください。 液体窒素から解凍した人血管内皮細胞を6ウェルに播種し、デンシティが8割くらいになったら24時間飢餓にさせます。その後、阻害剤をVEGF刺激を加える1時間前に3つ目のウェルに入れ、その後、VEGFを2つめと3つ 目のウェルに入れ、30分刺激したのち、ウェルを冷PBSで2度洗い、150ulのライシスバッファーで細胞溶解しました。 ところが最近結果が安定しません。 細胞はP4のものを液体窒素から解凍し、1週間ほどかけて増やしたのち、P5のものを実験に用いてます。 なぜかAktのリン酸化が本来は2つ目に見られるはずが、3つ目にのみ認められます...。 下流のシグナルもAktの結果から予想されるように3つ目で見られています...。 なぜだか2つ目のウェルはシグナルが入るポジコンのはずが、何もシグナルは動いておらず、3つ目の阻害剤を加えた方でむしろシグナルが動いていました。 これらの結果は以前の私の結果と全くの逆で、何かがおかしいのだと思います... ちなみに今回初めて解凍した細胞を用いました。これまでうまくいっていたのは細胞を購入してP4くらいのものを使用していました。今回はP4のものを解凍し、継代したP5を実験に用いています。 そこで原因究明を行いたいです。 私は阻害剤やVEGFを加える際、1-2mlのあらかじめウェルに入った飢餓溶液に1-10ulの容量を加えています。その後、速やかに回旋させ、37度インキュベータに移しています。 この旋回はシェアストレスなんかを誘導したりしますか？YAP/TAZがシェアストレスで誘導されると論文がありますし、どうなんだろうと...そんなに激しく旋回はしていないのですが。。試薬を加えてくるくるくると穏やかに旋回させ、その後たてたてよこよこくらいして混和させています。 もう一月になる点は、細胞の溶解方法です。 150ulで十分溶解できるとは思います。ただ、溶解方法は6ウェルを氷上で5分おきくらいに十分に旋回させ可溶化させています。その後、プレートに10度ほど傾斜を氷上で付けさせ、3分後くらいに下に集まる溶液を150ul回収しています。つまり、スクレーパーで掻きとってはいません。（6ウェルだとできないですよね？） その後、30ulの6xSDSサンプルバッファーを加え、ソニケーションを1分x4セットほどを行い、ボイルして電気泳動しています。抗体はワークしています。特異的なもので論文にもよく使われているものです。そしてシングルバンドです。 長く書いてしまいましたが、みなさんが細胞を刺激する方法（どれだけの容量の培地にどれだけの試薬を加え、どのように混和しているのか）、6ウェルからライセートの調製方法で私の方法で誤っているところ、改善すべきところがありましたらご教示いただけませんでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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