BioTechnicalフォーラム [GUSが染まらない原因]

GUSが染まらない原因

No.8442-TOPIC - 2019/11/25 (月) 16:43:07 - BlueComma

いつも勉強させていただいております。

GUSレポーターアッセイについて、GUSが染まらない原因として何が考えられるでしょうか？
ある遺伝子のプロモーター配列（CDSの"ATG"の数kbp上流）の直下にGUSを連結させています。プロモーターおよびGUSの配列が正しいことはシーケンシングで確認しています。遺伝子が発現することも確認済みです。
GUS恒常発現体（ポジコン）は染まるので染色液の問題では無いと思います。
　

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No.8442-6 - 2019/11/26 (火) 20:47:17 - BlueComma

とも様、おお様

説明不足で申し訳ありません。RNAの精製にはDNaseを含む専用キットを使っており、DNAの持ち込みが無いことは確認しています。

おお様

大変興味深いご指摘ありがとうございます。
kozak consensus sequenceのようにAUG contextが翻訳に関わるということは聞いたことがありました。レポーターアッセイでもそのような配列が影響する可能性がある、ということでしょうか・・・。また、レポーターアッセイに用いるプロモーター配列は長ければいいと思っていたので、Suppressorの存在は全く念頭にありませんでした。
ご指摘の内容を踏まえると、プロモーター配列を短くしてCDS融合GUSのコンストラクトで解析するのが吉、といった所でしょうか。

補足ですが、コンストラクト作製にあたってはGateway cloning systemを利用しています。プロモーターの3'端からGUSの5'端までの間に50 bp程度のjunctionがあり、そこには余計なATGが含まれていないこと・フレームシフトは起こっていないことはシーケンシングで確認済みです。

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No.8442-5 - 2019/11/26 (火) 05:14:25 - おお

>不勉強で恐縮ですが、逆転写PCRでmRNAではなくプラスミドが検出される場合があるのでしょうか？

DNaseで微量の持ち込みを消化してないと強いシグナルが検出される場合があります。プラスミドだけじゃなくゲノムでも同じことが起こりえます。RT-を必ず取るように心がけるといいです。

失礼な質問ですが、その遺伝子のATGとGUSのATGはインフレイムになってますか？またその遺伝子のATGをGUSのATGに入れ替えた場合、ATG以降の配列はどうでしょうか？というのは以下のような文献がありますので。

https://link.springer.com/content/pdf/10.1023%2FA%3A1005816823636.pdf

数kbp上流と言うことですが、そのConstruct上でSupressorが強く働きすぎている可能性はあるかもしれませんので少し削って行ってみてもいいのかもしれません。

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No.8442-4 - 2019/11/26 (火) 04:44:54 - とも

＞逆転写PCRでmRNAではなくプラスミドが検出される場合があるのでしょうか？

逆転写の前にDNase処理をしていないと、cDNA由来のものをPCRで検出しているのか、それともプラスミド由来のものを検出しているのかわからないと思います。

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No.8442-3 - 2019/11/26 (火) 02:34:05 - BlueComma

とも様

コメントありがとうございます。遺伝子発現は形質転換前（いわゆる野生型）のmRNAを用いているため、プラスミドが検出されることは無いと思われます。
不勉強で恐縮ですが、逆転写PCRでmRNAではなくプラスミドが検出される場合があるのでしょうか？

(無題)

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No.8442-2 - 2019/11/25 (月) 21:54:16 - とも

遺伝子が発現しているというのは確かですか？
そのPCRで検出しているのはmRNAではなく、プラスミドそのものだったりしませんか？