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初代培養時の組織洗浄
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No.8448-TOPIC - 2019/11/26 (火) 23:18:33 - 初代培養
初代培養時における組織の洗浄方法、皆様はどうされていますか?
私は胎児マウスを用いるときに70%エタノールに30秒間漬けています。しかし稀にコンタミしてしまうことがあり、本法では不十分ではないかと疑問を感じております。
そこで皆様が初代培養を実施する際に、検体の洗浄をどのようにされているのかお教えいただけないでしょうか。特に、汚染物質に触れやすい皮膚等での体験談をお聞かせいただけると助かります。
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No.8448-6 - 2019/11/27 (水) 09:10:59 -
TS
わたしもクリーンベンチで胎児を取り出します。
コメントにもあるように、コンタミは母獣の皮膚と毛からじゃないでしょうか。
毛はどうしても舞いやすいので、開腹するところをエタや消毒液でひたひたにするとか、剃毛してから開腹するとか。
(無題)
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No.8448-5 - 2019/11/27 (水) 07:43:22 - おお
70%エタノールのほうが95%とか高濃度アルコールより殺菌力が強いと言われてます。ただしアルコールを使わないほうがたいていと思われる中そういった処理が実験に影響しないかかなり不安です。
胎児なら親の皮膚などからの菌の持ち込みもあるかもしれないので屠殺後親の全身をアルコールで拭いてから解剖するのならわからないでもないです。
コンタミしやすい状況ではAntibiotic-antimycotic (Pen, Strep, Amphotericin B, 100X)などを使うことはあると思います。濃度も最初の取り出した直後とかなどでいろいろ工夫をしている論文も昔あったと思います。なので胎児を取り出したあと少し濃い目のAntibiotic-antimycotic のはいったPBSで表面を洗い流すというのも手かもしれません。Amphotericin Bはそれなりに毒性がありますので少し注意が必要かもしれません。
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/antibiotics.html
(無題)
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No.8448-4 - 2019/11/27 (水) 07:20:58 - 初代培養
皆さま
ご回答ありがとうございます。
操作環境を見直してみます。
あと殺菌方法についてもお聞きしたいのですが、洗浄操作(サンプルの漬け込み)では70%エタノールと99.5%エタノールで効果に差は出てきますか?また、培地にアムホテンシンBなど他の抗菌剤を入れるのは対策になるでしょうか?
(無題)
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No.8448-3 - 2019/11/27 (水) 03:59:09 - おお
胎児はもともとほぼ無菌と思ってもいいかと思います。なので通常アルコールなどで処理はしません。
したがってその他手技や環境など見直すべきかと思います。
(無題)
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No.8448-2 - 2019/11/27 (水) 01:26:40 - ***
装備
手袋、マスク
道具
ディスポのディッシュやチューブ、オートクレーブしたPBS
エタノールで洗浄したハサミやピンセット
方法
クリーンベンチ外で胎仔を取り出し、PBS中で組織を切り出しチューブに入れて遠心
クリーンベンチ内で上清を除いてペニシリン/ストレプトマイシン入りの培地で懸濁して培養
でたいていコンタミしない。エタノールにもつけない。参考にならないか。
初代培養時の組織洗浄
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No.8448-1 - 2019/11/26 (火) 23:18:33 - 初代培養
初代培養時における組織の洗浄方法、皆様はどうされていますか?
私は胎児マウスを用いるときに70%エタノールに30秒間漬けています。しかし稀にコンタミしてしまうことがあり、本法では不十分ではないかと疑問を感じております。
そこで皆様が初代培養を実施する際に、検体の洗浄をどのようにされているのかお教えいただけないでしょうか。特に、汚染物質に触れやすい皮膚等での体験談をお聞かせいただけると助かります。
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