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(無題) 削除/引用 No.8458-19 - 2019/12/16 (月) 18:40:10 - ベジ野郎 >[Re:18] うどんげさんは書きました : > 酵素反応時のDNA濃度はおよそ 1.7ug/10uLが上限かと思います。ミニゲル1レーン分として 0.2-0.5ug 処理して、改善しなければRNAではなくDNAと考えます、自分なら。ただ、高分子DNAは取れているようですし、既に指摘がある通り、用途によってはRNAや低分子DNAが無視できるとも思います。 アドバイスの通り希釈を行ったところRNAが消えました。 ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.8458-18 - 2019/12/14 (土) 10:36:35 - うどんげ 酵素反応時のDNA濃度はおよそ 1.7ug/10uLが上限かと思います。ミニゲル1レーン分として 0.2-0.5ug 処理して、改善しなければRNAではなくDNAと考えます、自分なら。ただ、高分子DNAは取れているようですし、既に指摘がある通り、用途によってはRNAや低分子DNAが無視できるとも思います。

(無題) 削除/引用 No.8458-17 - 2019/12/14 (土) 09:40:39 - SYBR master >[Re:15] ベジ野郎さんは書きました : > 原核生物です 一部の原核微生物は、バイオフィルムの材料として、細胞外DNAを出すことがあります。extracellular DNA (eDNA）です。これが存在するとき、細胞数から想定されるDNAより多くのDNAが取れてきます。 DNAを回収する前に、細胞をBenzonaseで処理してからゲノムDNA抽出すると良いかもしれません。Benzonaseは、標準bufferが提示されてませんが、1 mM以上のMg+が有れば、酵素活性が出ますが、100 mM以上のNaClが存在すると活性が阻害されます。 Benzonaseの代わりにDNaseIも使えますが、DNaseIは、dsDNAには強い活性を示しますが、ssDNAに対する活性は低いので注意してください

(無題) 削除/引用 No.8458-16 - 2019/12/13 (金) 19:48:18 - ベジ野郎 >[Re:14] うどんげさんは書きました : > RNase 処理は強力な手段なので最も勧められます。 > 自分なら、ゲノムDNA濃度が高過ぎたら50度で５分くらい温めて適当に希釈し、再度 RNase 処理と失活除去をします。高分子DNA に巻き込まれたRNA に酵素が効きにくくなっていると考えるからです。またRNase 処理時間が長すぎると、試料か試薬RNaseの夾雑物によって目的DNAも分解しそうです。15-30分でいったん失活除去、それで改善すれば1-2回繰り返します。 やってみようと思います。またDNA濃度はどのくらいがちょうどいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8458-15 - 2019/12/13 (金) 19:46:35 - ベジ野郎 >[Re:13] SYBR masterさんは書きました : > 生物種は何？16s rRNAということは原核微生物? > 原核生物です

(無題) 削除/引用 No.8458-14 - 2019/12/13 (金) 17:41:27 - うどんげ RNase 処理は強力な手段なので最も勧められます。 自分なら、ゲノムDNA濃度が高過ぎたら50度で５分くらい温めて適当に希釈し、再度 RNase 処理と失活除去をします。高分子DNA に巻き込まれたRNA に酵素が効きにくくなっていると考えるからです。またRNase 処理時間が長すぎると、試料か試薬RNaseの夾雑物によって目的DNAも分解しそうです。15-30分でいったん失活除去、それで改善すれば1-2回繰り返します。

(無題) 削除/引用 No.8458-13 - 2019/12/13 (金) 17:18:55 - SYBR master 生物種は何？16s rRNAということは原核微生物?

(無題) 削除/引用 No.8458-12 - 2019/12/13 (金) 13:08:43 - ベジ野郎 >[Re:5] おおさんは書きました : > https://www.promega.com/resources/pubhub/comparing-manual-and-automated-genomic-dna-purification-methods-for-genotyping-arrays/ > > ここにある写真よりひどいですか？ゲノムは普通に調製するとIntactで取れる事はなく大体平均５０から１００ｋｂｐのサイズに分布するようになります。また、小さいゲルで５マイクログラムは結構な量でオーバーロード気味かもしれません。 > > RNAはそうですね、PEG沈すれば除けるとは思いますが。 泳動するDNA量を減らしたところスメアはだいぶ改善しました。 しかし、RNA除去としてRNaseが効かなかったので、ここで教えて頂いたPEG沈を行いましたが除去がされません。 他のRNA除去とDNA・RNA以外でエチブロによる染色を受けRNAのようにゲルで発光するものは何があるでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8458-11 - 2019/12/04 (水) 05:26:31 - フル アガロースゲルはきれいですか？パウダーを溶かすバッファーが汚いと全体的ににごっているというか小さなごみがあるような、ぼんやりとしてしまいます。

Exposure 削除/引用 No.8458-10 - 2019/12/03 (火) 23:17:18 - たろう 写真を撮る際の焼き付け時間(あるいは露光時間とも)のことですよ。 画像素子に光を当てる時間を意味し、短くするとノイズとシグナルの両方が減ります。

(無題) 削除/引用 No.8458-9 - 2019/12/03 (火) 21:46:51 - ベジ野郎 Exposureとはなんですか？

(無題) 削除/引用 No.8458-8 - 2019/12/03 (火) 01:37:51 - おお まあ目的によってはそんなでも使えるとは思います。イメージを取得する（写真をとる）ときのExposureとか下げても同じ感じに見えるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8458-7 - 2019/11/30 (土) 10:10:42 - ベジ野郎 >[Re:5] おおさんは書きました : > https://www.promega.com/resources/pubhub/comparing-manual-and-automated-genomic-dna-purification-methods-for-genotyping-arrays/ > > ここにある写真よりひどいですか？ゲノムは普通に調製するとIntactで取れる事はなく大体平均５０から１００ｋｂｐのサイズに分布するようになります。また、小さいゲルで５マイクログラムは結構な量でオーバーロード気味かもしれません。 > > RNAはそうですね、PEG沈すれば除けるとは思いますが。 写真よりもひどくライン全体が光ってしまいます PEG沈試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8458-6 - 2019/11/29 (金) 22:21:08 - み ゲノムDNAならスメアになってあたりまえだろう。 同時にラダーマーカー流しておけば泳動の問題かサンプルの問題か区別できるだろ。

(無題) 削除/引用 No.8458-5 - 2019/11/29 (金) 20:43:18 - おお https://www.promega.com/resources/pubhub/comparing-manual-and-automated-genomic-dna-purification-methods-for-genotyping-arrays/ ここにある写真よりひどいですか？ゲノムは普通に調製するとIntactで取れる事はなく大体平均５０から１００ｋｂｐのサイズに分布するようになります。また、小さいゲルで５マイクログラムは結構な量でオーバーロード気味かもしれません。 RNAはそうですね、PEG沈すれば除けるとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.8458-4 - 2019/11/29 (金) 18:23:28 - ベジ野郎 文字化けしているところはμです

(無題) 削除/引用 No.8458-3 - 2019/11/29 (金) 18:22:21 - ベジ野郎 >たろう サンプル量はDNAが5μgになるように調整して泳動しています。 他のゲノムDNAは泳動したことはありませんが。16SrRNAなどPCR産物やマーカーもしっかりと分離が出来ています。

(無題) 削除/引用 No.8458-2 - 2019/11/29 (金) 18:14:50 - たろう ひょっとして、サンプル量が多すぎるということはないでしょうか？ あとは、アガロースゲルの品質がよくない可能性もありそうな気がします。 本件のゲノムDNA以外はスメアにならずに綺麗に分離できていますか？

アガロースゲル電気泳動　汚い 削除/引用 No.8458-1 - 2019/11/29 (金) 18:05:42 - ベジ野郎 ゲノム抽出キット(プロメガ)を用いて抽出したDNAをアガロースゲル電気泳動したところ、全体がスメアになってしまいます。またRNAが残存しているようなぼんやりしたバンドがゲルの下の方で出てしまいます。RNase処理（RNase4mg/mL　3µLを600µLに混合）を24h反応させています。原因は何が考えられるでしょうか？ またRNase以外でのRNA除去方法は何がありますか。

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