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(無題) 削除/引用 No.8501-6 - 2019/12/17 (火) 05:40:42 - asan 低分子なんて、正直５分もあれば抑制効果は十分あると思いますよ。 基本、タンパク質に対しては過剰量のモル数で入ってると思うので。 実験のデザインによってはやり方や考え方は色々でしょうが、培養細胞で阻害剤処理する場合に刺激よりも前処理するなら1h-３０分程度というのは慣例的には妥当な範囲のことが多いし、６時間とか１２時間も処理しても、培養液中でどこまで低分子が安定に維持されてるかなんてわからないけどね。 定常状態に低分子を加えてそのリスポンスを見る実験でも、あまり長時間処理すると、リン酸化だけの１次的変化だけでなくて転写とかもはいってくるので話が複雑になるとおもいますから、通常は長くても数時間とかもすれば十分だと考えるのではないかな。 ちなみに考えれば当たり前ですが、よくある誤解でたとえばU０１２６はpERKは落ちますが、抑えてるのは、MEKのリン酸化活性。つまり、アウトプットのリン酸化自体が脱リン酸化されるってのと、キナーゼの活性を抑えるってのは似てるようで違うから時間によってはたまに矛盾してるような結果が出ることもある点注意です。

(無題) 削除/引用 No.8501-5 - 2019/12/16 (月) 23:31:59 - クァws絵drftgy不二 論文情報を参考に何点かタイムコースで見てみることは必要と思う。細胞が違うと最適条件もまた違うので。 あと濃度も何点か振ってみることも大切と思う。阻害剤といっても他の分子に対して働かないという保証はないので、濃度が上がれば、それだけ非特異的な事象をみるリスクも高くなるので、必要以上に高い濃度は避けるべきだし。代謝されるような化合物だと細胞内半減期が短いものは持続的な暴露も必要かもしれない。 この辺りは本実験の前の予備的検討としてみなさん普通にすると思う。

(無題) 削除/引用 No.8501-4 - 2019/12/16 (月) 11:18:47 - TS 細胞に浸透するのは30分もあれば十分と思いますし、リン酸化の半減期を考えてもやはり短時間で大丈夫な気もしますが、結局、１つのタイムポイントで良い結果を出そうとは考えずに、濃度や処理時間を少しはふってみるべきかなと思います。 一般的には、LYやU0126であれば短時間でよいでしょう。作用機序の観点から、ときどき長時間必要なものもありますよ。百日咳毒素とか。

(無題) 削除/引用 No.8501-3 - 2019/12/16 (月) 11:05:34 - セル ちきさん、ありがとうございます。 真意が伝わっていないようでその点は私の書き方の不始末を反省しなくてはないませんね。 質問は阻害剤個々ではないんです。培養細胞であれば、常識的に考えて1時間で十分阻害しているのではないですか？という質問です。逆に、阻害剤処理を12時間や6時間というのは必要ないのではないか？というのが疑問です。もちろん長時間阻害剤での全処理を行う目的として、Yではなくその下流のZなどもっともっと下流のシグナルをシャットダウンする目的だと思いますが。 もう一度、質問させてください。 マウスなど個体ではなく、培養細胞にシグナル分子Xに対する膜透過型阻害剤を加える場合の処理時間に関して、1時間で十分だと考えて妥当だと私は考えるのですが、一般的にどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8501-2 - 2019/12/16 (月) 09:21:25 - ちき 文献はいくらでもありそうですし、阻害剤のデータシートにも情報はあると思います。それに、たとえ情報が十分でなくても、自分でパイロット実験をしようと思わないのが不思議です。

培養細胞の阻害剤の処理時間 削除/引用 No.8501-1 - 2019/12/16 (月) 08:51:50 - セル 培養細胞の阻害剤の処理時間について質問させてください。 私は様々な細胞内リン酸化シグナリングを解析しようとしています。 そこで阻害剤を使うことも考えており、その処理時間につきご相談したいのですが、よろしいでしょうか？ すみません。 培養細胞ですので、阻害剤の標的分子への到達は個体に投与するより遥かに容易で、単純だと思います。（吸収、代謝、分配、排泄を考えなくていいという意味でです。） それなら、阻害剤の処理時間は膜透過性が十分にある化合物なら1時間もすれば十分ではないか、と私は考えるのですが、中には12時間以上処理したりと様々です。例えばXとYという2つの分子が直列で経路を構成しているとして、Xを阻害してYのアウトプットを見るという実験を展開したいです。 これなら1時間でも十分ではないのでしょうか？ 例えばLY294002, U0126などです。

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