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(無題) 削除/引用 No.853-12 - 2012/08/27 (月) 05:49:43 - おお >DMSOが入ってる状態で遠心することにセンシティブな これでおもいだしましたが、とくにDMSOにセンシティブと思えない細胞で、遠心してけいだいした所、弱ってしまったことがあります。その研究室では遠心はしてないとのことで、わたしがそこに移る前のラボでは同じ細胞株を遠心してけいだいしてなんの問題がなかったわけです。細胞がしばらくどのようにして飼われていたかによってもそういう微妙なさが出たりというのもあるようです。 DMSOがどうしてもダメな細胞はグリセロールを使って凍結は一応可能ですが、毒性もある程度でますので、viabilityは下がってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.853-11 - 2012/08/26 (日) 21:15:39 - カイ DMSOが入ってる状態で遠心することにセンシティブな細胞もあるんですよ。 そういった細胞の場合は、解凍、培地で希釈（10％FBSで10倍以上の液量)、そのまままき、張り付いたら即培地交換です。 細胞を手に入れた先（企業)のデータシートに記載されています。 そうじゃない場合は、みなさんがおっしゃるように解凍、培地で希釈の後、低速度で遠心、即培地を除き、培地に懸濁してまく。だいたい次の日に培地交換します。 293、293T、HeLa、Hep、U2OSは、別にDMSOが入った状態での遠心はタブーじゃなかったはずなので、通常の解凍プロセスで問題ないです。 が、習った細胞扱いの手法を全細胞に適応できると思ったら間違いなので、注意が必要な細胞もあるので、一度ATCCなりLonzaなり細胞を手に入れた企業のデータシートは読んでおくべきでしょう。 あと、凍結用の培地はあらかじめ作成し、冷やしておく（DMSOを混ぜると温かくなるので、細胞によくない) 凍結はゆっくり、‐２０度に一度置く人もいますが、私は‐８０度、発泡スチロールのチューブたてでくるむか、細胞凍結用のケースでします。 みなさんご存知かと思うので蛇足かもしれないですが、一応。 (゜Д゜さんが「速攻で」とおっしゃっていてそこんトコロを誤解されたらいけないと思ったので。 速攻で‐８０度に突っ込むべく走るんですが、細胞そのものはゆっくり凍らすボックスに入れます。

(無題) 削除/引用 No.853-10 - 2012/08/26 (日) 14:41:42 - (゜Д゜ 7が言うように、たしかにDMOSは気をつけないとある意味ヤバいな。あれHDAC inhibitorの親みたいなもんだものなあ。

(無題) 削除/引用 No.853-9 - 2012/08/26 (日) 11:26:13 - おお あと細胞凍結用溶液とか売ってますね。血清と比べてどちらが割高なんでしょうか。 凍結する時は大抵細胞を飼っているときのFBSを使いますから、ロットを気にすることはわたしはないです。

脱線しますが 削除/引用 No.853-8 - 2012/08/26 (日) 10:48:45 - PingPongPang 　血清についてはロットチェックして纏め買いするなど購入には結構な手間がかかります。しかるに、凍結保存に血清１００％を使うとなれば、なんか勿体ない（贅沢だなー）という思いが最初に浮かびました。 　ここから脱線していきますが、市販の凍結保存液には血清を使用しているものもあります。 　これら血清含有商品の血清についてはロットチェックは不要なのでしょうか？　 　凍結／融解の短時間なら血清ロットの影響は無視できるものなのでしょうか？ （ちなみに私のやり方は　ポスドク派ですね。　剥離後washするし、凍結は１０％FBS入り培地にDMSOを１０％加えるやり方です。　あと、１０％DMSO入り培地は前もって作っています。）

(無題) 削除/引用 No.853-7 - 2012/08/26 (日) 07:00:18 - おお 簡略かできるところはそちらの方をとればいいかと思います。 細胞けんだく液に直接DMSOを入れるというのは感覚的にやばいと思えるのですが、そう思わない人もいるのですね。単なる感覚の違いでしょうか。 凍結保存時にFBSやDMSOはそんなに問題がないと思いますが、FBSで分化が促進されたり、DMSOで分化が促進されたりする細胞もありますので、そうでない場合はFBSに10%DMSOで保存しています。まあFBSで保存すると10%FBSのバイチより10倍量FBSを使うわけで保存するチューブの量によってはコストの考慮も考えるべきなのかもしれません。 ATCCでは5%DMSOを含むバイチが凍結保存に推奨されています。C2C12はDMSOで分化しますから10%DMSOで保存している人もいるでしょうけど(それでOKだとおもいますが)低い方が気持ち的にいいかもしれませんね。解凍するときにバイチで10倍に薄めてディシュにまき数時間培養してバイチを交換する人もいるようですが、DMSOセンシティブな細胞ではやめた方がいいですね。

(無題) 削除/引用 No.853-6 - 2012/08/23 (木) 01:12:44 - (゜Д゜ 1. について 汎用されている大抵の細胞株はどっちでも問題なくいける。ポストドクのやり方が標準法としたらセンセのやり方は簡便法という感じかな。 2. について いろんなやり方あるし、その方法でやってみて再培養したとき細胞が元気に増えれば（どの方法が正しいかということより、これが一番大事なことだな）どれでもいいんじゃね。 3.全部混ぜて凍結保存液を調製してからそれに細胞けんだくして、したらできるだけ速攻で-80Cで凍らす。 細胞培養はその人が最初に習った研究室／大学の流儀とかの影響で、どうしても個人個人でこだわりというかやりかたがけっこう違うし、やり方を見るとその人のバックグラウンドや出身がわかるとか言ってるひともいる。けっこうおもしろい。

(無題) 削除/引用 No.853-5 - 2012/08/22 (水) 10:27:23 - flu 細胞浮遊液にDMSOの原液を直接混和すると、混和の過程で高濃度のDMSOに触れた細胞が死にます。なにしろ有機溶媒が細胞にモロにあたるわけなので。 同様に、細胞培養に試薬を添加する実験の際に、試薬のストック溶液がDMSOに溶解してあるような場合、そのDMSOストック溶液を直接ウェルやdishに添加すると、添加したところの直下の細胞が死んでいることもよくあります。

もう答えは出ているので 削除/引用 No.853-4 - 2012/08/22 (水) 01:52:12 - 直輝 ご質問への答えを含め、ここに良い事がたくさん書いてありますよ。 理研 CELL BANK 培養マニュアル http://www.brc.riken.jp/lab/cell/manual/ あとは、細胞を凍結保存した後に１本だけ起こしてみて、ちゃんと起きるかチェックするくらいかな。

(無題) 削除/引用 No.853-2 - 2012/08/22 (水) 01:16:00 - TK-1 細胞に寄るけど、ここに書いてあるcell lineなら別にどっちでもいいと思う。 1) トリプシンそのものはFBSを加えた時点で活性がなくなるから、あとはvolumeの問題。最終的にトリプシンの溶液の量に対してmediumが１０倍とかそれ以上なら問題ない。もし希釈せずにまかないといけない場合は遠心します。 ２）”通常のDMEM+10%FBS培地にDMSOを10%で加えると、FBS終濃度が下がってしまいます”はい、どれだけ下がりますか？１０％と９％の差でそんなに差が出ると思いますか？ ３）DMSOを加えるときに熱がでるので、sensitiveな細胞であれば気を使うけど、いずれの方法も使いません。DMSOなしの溶液にサスペンドして、そこに等量の20%DMSOの溶液を加えてgentleに混合します。 頭を使うことと、あとは自分の周りで問題なくやっている人とcommunicationを取ってください。あとはいわゆる指導書のようなものがあるので自分で読んで理解してください。こんなところで見ず知らずの人に聞くのは一番最後。

細胞培養の基本的な手法について 削除/引用 No.853-1 - 2012/08/22 (水) 00:56:38 - tail ラボ内でボスと他のポスドクとで細胞培養の基本的な手法が違っています。当方細胞培養の経験が浅く、どの方法が最適か、判断しかねております。細胞は、293T, 293, HeLaがメインですが、今後HepやC2C12, U2OS, 神経系培養細胞などの細胞のうち、いずれかを選択して293と平行して使っていく予定です。 １）スプリットする際に、トリプシン含有培地をwashするかどうか。ボスは、トリプシン後にDMEM(+10%FBS)を加えた後、そこから適当量を採取して新しい培地上にプレートするそうです。もう一人のポスドクの方は、毎回スピンダウンしてトリプシンを除き、新しい培地に懸濁してそこから細胞を採取、プレーティングしているそうです。 ２）凍結ストックを作る際、ボスはFBSのみを、ポスドクはDMEM+10%FBSに、それぞれ10%DMSO加えたものを使っています。また、DMEMとFBSを1:1で混合したものにDMSOを加えるという方法も聞いたことがあります。FBSが多い方が良いという理由のようで、確かに通常のDMEM+10%FBS培地にDMSOを10%で加えると、FBS終濃度が下がってしまいます。凍結保存用だけDMEM+20%FBSにしてみることも考えておりますが、皆様どのように行っていらしゃいますか？ ３）凍結用の培地は、予めDMSOと混和しておく方が良いのか、先に細胞ペレットを培地(+FBS)で懸濁してからDMSOを加えるのが良いのか。 基礎的な質問ばかりで大変恐縮ですが、ご教授のほど宜しくお願い致します。

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