核染色さん、おおさん、ありがとうございます
配列は全く同一です。タグは有り無し両方作りましたが、市販の物はタグがついています。タグとの間のスペーサーに関して、カンパニーに連絡してどうなってるか聞いて同じ（スペーサー無し）にしました。
続きとして書いてる途中だったのですが、培養上清に関していうと、FBS10%、1%、ゼロの３つの状態で作成しました。これをELISAにかけると、FBS10%のものはゼロに比べて10−15%程度高い濃度が結果として出ます。FBS由来のタンパク質に由来しているかもしれないし、単に細胞のタンパク作成能が高いからかもしれませんが、まあ10−15％程度の違いだからあまり深く考えずにいました。1%とゼロだとELISAの結果はほぼ同じですが、3日目となるとゼロでは細胞が半分程度死んでいます。60％コンフル程度でトランスフェクションして、FBSゼロが約50%、FBS1% が85−95％程度、FBS10%でOver Confluentというコンフルエンシーになっています。3日目まで待たず、2日目で回収しても良いのかもしれません。
>市販の組換えタンパク質を既知の量をHEK293培地に加え、それでもきちんとELISAで測定できるでしょうか？
これはまだ試したことがありません。やってみようと思います。
空ベクターを発現させた培養上清では、FBSが10%でもNDでした。
>同じような実験ですが、既知の量の市販のものとトピ主さんが調製されたものを隣同士でSDSPAGEし、抗体で検出した際に、同じ強さのバンドを認めることを確認されていますか？
これは確認しました。似たような強さのバンドになります。かなり強くシグナルが出るので、サッチっていて同じに見えるだけで、実際には半分以下、といったことはあるかと思い、一度半分量、10分の１量を流して比べたことがありますが、似たような強さのシグナルでした。
ライガンドを細胞に振りかける際、よく使われる濃度がX ng/mLですが、5X、10Xをふりかけても結合が見られることは報告されていて、自分でHEK293で作ったライガンドをこの量（X,5X,10X)に調整してやってもみましたが、結合は見られませんでした。市販のリコンビナントではどの量でも結合が確認できました。
>培養上清は何日目のものでしょうか？
3日目です
>目的の組換えタンパク質の分解や、トランスフェクション時に細胞が死んでいたりしませんか？
分解に関しては、市販のリコンビナントをWBのポジティブコントロールとして使っていますが、似たようなサイズのバンドが見られます。トランスフェクション時には細胞は死んでいませんが、FBSゼロではやはり3日目に細胞は死んでいました（ので、FBS1、10%でもトライし始めました）。
>あまりに死細胞がいると、きちんとフォールディングを受けなかったものや、部分分解されてしまっているもの、翻訳ご就職が適切ではないものが上清中に現れているかもしれません。それらをELISAでも検出してしまっているかもしれませんね。
>細胞のキャパ以上の発現により糖鎖修飾やフォールディングなどが完結してなかった。
出来る限り収量を上げたくて、3日目まで待っていましたが、もしかしたら2日目（場合によっては1.5日？）に回収すれば、そういった不完全なタンパクを拾わずにすみ、結合が見られるかもしれないと思い始めました。 |
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