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in situ Hyb.のプローブの設計 トピック削除
No.854-TOPIC - 2012/08/22 (水) 10:51:10 - M
in situ Hyb.のプローブを設計する時、みなさんはどういうプローブを設計されていますか?

成書には、様々な長さが推奨されていたりします。
例えば、RNAプローブだったら長鎖を分解させ使うプロトコールだったり、かたや100base程度で設計してしまう人もいたり。

PNAプローブとかですと非常に最初から20bp程度の短い制約があったり。

実験目的によって、異なることやターゲットとするものの発現量による相違は理解していますが、「こういう時、こういうふうにした」というような様々なご意見を聞いてみたいと思い質問いたします。

私は、FFPEや凍結切片のin situ Hyb.をする機会が多いのですが、RNAプローブで200~500base程度でいくつか設計し、分解せずにそのまま使うことが多いです。設計段階では、塩基の偏りは気をつけます。
BLASTにも一応はかけていますが、あまり重視していません。

検出は、蛍光か化学発色で行なっております。

診断用に流通しているPNAプローブ等を用いる時は、20base程度のものを使いますが、自分では数十base程度の短いRNAプローブもPNAプローブも設計したことはありません。
(なんとなく、100base以下になってきますと、ラベルされる標識量も減って感度が下がりそうな印象があるもので)

漠然とした内容ですが、様々なみなさんのご意見が聞けると良いなとおもいます。
 
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(無題) 削除/引用
No.854-4 - 2012/08/23 (木) 18:12:00 - M
書き込み有難う御座います。

>>組織さん
LNAプローブはリアルタイムPCR用では多用しておりますが、in situ hyb.で使用したことは無いです。ラベリング量が少ない点が、大丈夫かなと思ってしまいます。配列上の制約がある点が、今ひとつin situ用には一般的になっていない原因の一つじゃないかと思ったりします。

>>APさん
診断用のプローブの長さは、仰るとおりだと思います。
1kを超えて長くすると、クロスハイブリに悩まされる可能性も高くなるかなと思っておりましたが、そうでもないようですね。
かくいう私は、なんとなく長さをコントロール出来ない点が不安で、数百程度のプローブを先に作って、よさそうな候補を複数混ぜてハイブリを行なっております。
せっかちな性分で、私は結果が気になって、先に組織を染めてしまってから、後からデータ補強のためサザン、ノーザンをやることが多いです。

(無題) 削除/引用
No.854-3 - 2012/08/22 (水) 18:25:16 - AP
診断用プローブが短いオリゴであることが多いのは、プローブの鎖長が短いとハイブリにかかる時間が短くて済むので、短時間で迅速に結果を出す必要がある診断・検査に適しているからでしょう。ハイブリにo/nや2o/nもかかるようでは診断には向きませんから。

ハイブリの反応速度の目安にCot1/2、つまり一本鎖に解離した相補鎖のうち1/2の分子が相補対形成するまでの時間というのがあります。Cot1/2は鎖長に比例するので、鎖長が短いほどCot1/2は小さく、つまりハイブリの速度が大きくなります。プローブの濃度(高いほどCot1/2は小さくなる)などほかのパラメータにもよりますが、オリゴプローブならCot1/2は一時間もないと思います。

ただし、オリゴプローブ一分子に付けられる標識量は限られているので、標的RNA分子が豊富な遺伝子が対象ですね。



私は、ISHに使うプローブはまずノーザン、ゲノミックサザンをやって、ユニークなバンドを検出できる実績のある配列を使います。反復配列などクロスハイブリする配列があればエキストラバンドとして見えますし(見えなければ、あったとして反復配列は問題ないわけ)、もちろん目的のRNAを検出する能力のある配列であるかどうかは一目瞭然です。
プローブ長は、数百〜2,3 kbくらいの範囲で。原理的に感度を稼ぐためにはなるべく長いほうがいいので、できるだけそうします。300 nt程度に(といってもコントロールは出来ませんが)断片化は行います。

標的RNAの豊富さが遺伝子ごとに違うわけですから、プローブの長さはこの値がいいとか、これだけあれば十分だとかいうのは無いはずです。

(無題) 削除/引用
No.854-2 - 2012/08/22 (水) 11:22:14 - 組織
DIG標識RNAプローブ、300〜800bp程度、サイジングなし
BLASTでチェックしてできるだけ特異的な配列を選ぶ

染色成績についてはケースバイケースで、試してみないと分からないという感じです。
LNAプローブに興味があるので、使用経験のある方がいればコメントお願いします。

in situ Hyb.のプローブの設計 削除/引用
No.854-1 - 2012/08/22 (水) 10:51:10 - M
in situ Hyb.のプローブを設計する時、みなさんはどういうプローブを設計されていますか?

成書には、様々な長さが推奨されていたりします。
例えば、RNAプローブだったら長鎖を分解させ使うプロトコールだったり、かたや100base程度で設計してしまう人もいたり。

PNAプローブとかですと非常に最初から20bp程度の短い制約があったり。

実験目的によって、異なることやターゲットとするものの発現量による相違は理解していますが、「こういう時、こういうふうにした」というような様々なご意見を聞いてみたいと思い質問いたします。

私は、FFPEや凍結切片のin situ Hyb.をする機会が多いのですが、RNAプローブで200~500base程度でいくつか設計し、分解せずにそのまま使うことが多いです。設計段階では、塩基の偏りは気をつけます。
BLASTにも一応はかけていますが、あまり重視していません。

検出は、蛍光か化学発色で行なっております。

診断用に流通しているPNAプローブ等を用いる時は、20base程度のものを使いますが、自分では数十base程度の短いRNAプローブもPNAプローブも設計したことはありません。
(なんとなく、100base以下になってきますと、ラベルされる標識量も減って感度が下がりそうな印象があるもので)

漠然とした内容ですが、様々なみなさんのご意見が聞けると良いなとおもいます。

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