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(無題) 削除/引用 No.8563-2 - 2020/01/16 (木) 02:59:56 - コントロール アイソタイプコントロールを置いていますか？ 洗浄しないとバックがかなりたかくなりますが。 二次抗体なし 二次抗体だけ、洗浄なし 二次抗体だけ、洗浄あり でぜひ比較して欲しいです。 KDが大きい抗体では洗浄でどんどん剥がれていきますね。

FACS時の細胞のWashについて 削除/引用 No.8563-1 - 2020/01/15 (水) 21:25:26 - FACSマン いつもお世話になっております。 FACSで細胞表面タンパク質の発現解析を行っているものです。 2次抗体をBuffer (0.1% BSA, 1mM EDTA, PBS(-))に溶解し、1時間反応を終えた後、みなさんどのような手順で細胞を回収するのか教えていただきたいのです。 と言いますのも、2次抗体処理後、遠心し上清を取り除いた後、Washを行わずにそのまま再度bufferにて懸濁してFACS解析すると目的のタンパク質発現が確認できますが、しっかりと未反応の2次抗体を除こうという目的で、同様のbufferにてwash, 遠心の作業を一度追加し、再度bufferに懸濁してFACS解析を行いますと、タンパク発現が確認できなくなるという経験があります。 ノンスペの可能性もあるのかもと思いましたが、既知の報告と同様に発現の低いタンパクは低くでますし、明らかに2次抗体処理後にWashすることによって、1次抗体と2次抗体との結合が外れるなどの問題が生じるのではないかと考えています。 同様の経験をされた方はおられますでしょうか？ もしおられましたらコメントいただけますと嬉しいです。

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