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Ct値の再現性について トピック削除
No.8567-TOPIC - 2020/01/17 (金) 10:56:23 - ぶろっく
こんにちは、薬学部の5回生です。

ただいまマウスの肝臓からRNA抽出をして逆転写反応そしてPCRをかけたところGapdhのCt値が約18.5くらいでした。先輩からの指示でDNaseとエタノール沈殿をかけて同じく逆転写反応、PCRをかけた時にCt値の再現性がとれるか検討する実験を行いました。

実験手順は以下の通りです。

DNase処理(1回目)
・RNAの必要量を6µgとした(測定したRNA濃度=3.183 µg/µL)

RNA in water(µL) 1.83
Buffer(µL) 1.0
DNase(µL) 6.0
DEPC処理水(µL) 1.14
全量 10µL

37℃, 30min, インキュベート
stop solution 1µL 加える
65℃, 10min, インキュベート


エタノール沈殿
Sampleの液量を100µLにfull up(1.5mLチューブ)
99.5% EtOH 250µL
3M酢酸Na 10µL
タッピング
-80℃,30min, 放置
遠心分離(18,000×g, 4℃, 15min)
上清を捨てる(普通に流す)
75% EtOH 250µL
洗浄
遠心分離(18,000×g, 4℃, 15min)
上清を捨てる
風乾(10min)
10µLのDEPC処理水に溶解
吸光度測定
RNA濃度=0.197µg/µL

それからいつも通り逆転写反応とPCRをかけました。
Ct値は約25と大幅に高くなった。

考察した問題点と解決策
・回収率が約30%しかないしトータルRNA量としても少ないのでRNA必要量を6µgから12µgに増やした。RNAの濃度が低い時に希釈時にトータルRNA量を調整してはいるが前回も高いCt値を示したことがあったので。
・-80℃放置の時間が足りなかったので30minから1hまで放置した。
・遠心分離の時間も15minから30minに増やした。
逆転写酵素が古い可能性があったため新しいものを使用した。

以上のことをすべて行った結果Ct値が約20.4まで下げることには成功したが最初に測定したCt値約18.5との比べると再現性がとれていたとは言い難い結果になってしまった。

長くなってしまいましたが、他にどのようなことを行えばCt値がもっと下げることができると思いますか?
 
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11件 ( 1 〜 11 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.8567-11 - 2020/01/17 (金) 23:02:03 - おお
収量がすくないなら、わたしはまずRNAの分解を考えます。やられるときは結構かんたんにやられます。あと気になったのはエタ沈のときアルコールを加えてから酢酸ナトリウムを加えてませんかね、、、個人的には手癖かもしれませんが、塩をくわえてからアルコールです(いちどいわゆる新米のとき塩を加えるのをわすれアルコールを加え、あとから塩を加えたけど収量が悪かったというけんけんがあります。もともとあまりなかったのか、エタ沈のときのロスなのかなど検証してませんので結論を言えるほどではありませんけど)。

あと酸性ではRNAの測定値はなどかなり乱れるので、測定する分にとったRNAはバッファー効果があるもので希釈してから使うといいでしょ。エタ沈後は酢酸ナトリウムで酸性に偏っている可能性がたかいです。

DNase処理後もCt値がおなじになるという考え方は危ういかもしれません。まあ環境が変われば変化してもおかしくないので。その前に致命的なところはGAPDHはゲノムからはかからないのですか?シュードジーンがいっぱいあるという記述もどこかにあったような、、、

まあそういう致命的なところがないとするなら、RNA極端な分解がないならGAPDHと他の遺伝子でQPCRしてDelta Ctに大きなブレがなければOKでいいのかと思いますが。

またDNaseのInactivationですが、加熱処理はRNAにもあまり良くないのでエタ沈である程度失活してたらいいかなと。どうせプライマーくわえてまた加熱するわけだしとおもってます。

(無題) 削除/引用
No.8567-10 - 2020/01/17 (金) 13:21:21 - AP
>1) どのようにするのでしょうか?
>サンプルをdepcで希釈ですか?

微量のサンプル核酸だけだと吸着でのロス率が大きく、しかも濃度によってロス率が一定でない(低濃度ほどインパクトが大きい)ので、適当なキャリア(yeast tRNA, poly ICなどの合成核酸、BSA, lear PAなどなど)を過剰量含む希釈バッファーを使うべきです。サンプル核酸を希釈したとしても、溶液全体の溶質が過剰量で、濃度を一定に保てるように。
さらに界面活性剤を加えるのもいい。
希釈バッファーは市販品もあります。

(無題) 削除/引用
No.8567-9 - 2020/01/17 (金) 13:02:01 - aaa
すでに言われていますがRT-PCR で検出用プライマがエクソン内を増幅する場合は totalRNAのDNase 処理が必須で議論の余地がありません。DNase 処理と精製過程でtotalRNAの回収ロスは必ずあります。Ct値を下げるにはPCRに加える鋳型コピー数を増せばよいです。またPCR の増幅が指数関数的に増幅している範囲でスレッショルドラインを変更することができます。鋳型cDNA希釈液は0.05%Tweenなどを用い、必ず低吸着チップ・チューブを使います。

(無題) 削除/引用
No.8567-8 - 2020/01/17 (金) 12:46:35 - AA
ddCt法であることを前提にコメントしてしまいましたが、
プライマーセットの増幅効率がほぼ一定であることを確認する目的で、
cDNAの段階希釈系列を作り検量線を引くと思います。
質問者さんの場合は研究室にすでにあるセットを利用されるようなので、増幅効率の確認自体は不要ですが、逆に想定通りの効率が得られるかどうかで手技を確認出きると思います

(無題) 削除/引用
No.8567-7 - 2020/01/17 (金) 12:31:27 - AP
>・-80℃放置の時間が足りなかったので30minから1hまで放置した。

EtOH pptの前にフリーザーで冷やすという作法は、もう30年以上も前に言われていたことで、とっくに廃れています。冷やす意味がないばかりでなく、かえってEtOH pptの効率を落とすということが検証実験の上明らかにされたからです。
冷やす暇があったら、その分、遠心時間を伸ばしたほうがよろしい。

(無題) 削除/引用
No.8567-6 - 2020/01/17 (金) 12:25:59 - AP
そういうことだったら、
・逆転写あり(RT+)と、 系からRTaseを除いた逆転写なし(RT-)で比較検討する。
・予備実験にはイントロンのある遺伝子(Gapdhでいいわけだが)で、イントロンを挟むプライマー設計をする。RT-PCRはリアルタイムではなくエンドポイントにして、泳動で産物にゲノム由来が検出されるかどうか、検出されるとしたらどの程度かを見る。

とかするべき、というかそれが定石じゃないか?

EtOH沈殿後に核酸が目減りするのは当たり前だし、内部コントロールで標準化して定量するのが普通なので、目減りしたことなんかで揺らぐも系では無いはず。

また、DNase処理で純粋にDNAのあるなしだけが変わるだけじゃなく、RNAに影響がないとは限らない、というか影響がないと決めつけるのはおめでたすぎる。
DNase処理やその後処理はRNAの量や質にも影響しますよ。メーカーは許容範囲だと言っているだけで、決してRNAが無傷だと保証しているのではない。実際、DNaseの不活性化を熱処理である場合、バッファー中の金属イオンが触媒になってRNAが分解されます。たっぷりのEDATを入れてやる必要がありますが、ダウンストリームの実験にそのまま使えるようにするために、市販品ではかなり濃度が薄く設定されています。RNAも全く無傷だとはいきません。

それに、サンプルごとのばらつき、あるいはどういう処理を施したかで逆転写効率は影響されやすいですから。DNase処理、その後処理によってDNAの除去だけが起こったとは言えない。夾雑物や精製度が変化して逆転写効率が影響を受けて定量上の変化を起こしているかもしれない。普通は内部標準で標準化するからそういうのは丸められるのですが、あなたの実験系のように処理前と後だけ比較するのでは、その影響の可能性を排除できない。

(無題) 削除/引用
No.8567-5 - 2020/01/17 (金) 12:10:07 - けろっぐ
横からすみません
PCRをするときに元検体の段階希釈系列を作って確認していますでしょうか?

1) どのようにするのでしょうか?
サンプルをdepcで希釈ですか?

2) CDNA作成の際の希釈でも有効ですか?

(無題) 削除/引用
No.8567-4 - 2020/01/17 (金) 12:05:11 - AA
目的の遺伝子のプライマーセットがゲノムも増幅してしまう、
ということであれば、再現性云々はともかく、はじめからDNase処理を必須にするべきですね。

それはさておき、定量PCRはピペッティングのエラーを大いに拾う実験です。
特に異なる回の反応由来の値同士を比較するのは不慣れな人だとかなり難しいと思います。
PCRをするときに元検体の段階希釈系列を作って確認していますでしょうか?
検量線が直線で引けない濃度域だったりするとほんの僅かな差で大きな違いが生まれます。

(無題) 削除/引用
No.8567-3 - 2020/01/17 (金) 11:30:09 - ぶろっく
今回はマウスのGapdhを用いましたが自分がこれから測定したいのがUGTのmRNAで、これがエクソンをまたいでいないことが多いため、その手技練習としてDNase、エタノール沈殿を行いCt値の再現性がとれるか確認したいようです。

まだPCRを初めて2か月くらいなので自分の手技が良くない可能性も十分に高いですが。

(無題) 削除/引用
No.8567-2 - 2020/01/17 (金) 11:09:15 - cat
正直、先輩の指示の意図がさっぱりわかりませんし、ここで聞かなければいけない環境であることが理解しがたいのですが・・・・
これはラボの伝統ですか?

再現性の確認(練習)について議論する必要があるかと思います。

Ct値の再現性について 削除/引用
No.8567-1 - 2020/01/17 (金) 10:56:23 - ぶろっく
こんにちは、薬学部の5回生です。

ただいまマウスの肝臓からRNA抽出をして逆転写反応そしてPCRをかけたところGapdhのCt値が約18.5くらいでした。先輩からの指示でDNaseとエタノール沈殿をかけて同じく逆転写反応、PCRをかけた時にCt値の再現性がとれるか検討する実験を行いました。

実験手順は以下の通りです。

DNase処理(1回目)
・RNAの必要量を6µgとした(測定したRNA濃度=3.183 µg/µL)

RNA in water(µL) 1.83
Buffer(µL) 1.0
DNase(µL) 6.0
DEPC処理水(µL) 1.14
全量 10µL

37℃, 30min, インキュベート
stop solution 1µL 加える
65℃, 10min, インキュベート


エタノール沈殿
Sampleの液量を100µLにfull up(1.5mLチューブ)
99.5% EtOH 250µL
3M酢酸Na 10µL
タッピング
-80℃,30min, 放置
遠心分離(18,000×g, 4℃, 15min)
上清を捨てる(普通に流す)
75% EtOH 250µL
洗浄
遠心分離(18,000×g, 4℃, 15min)
上清を捨てる
風乾(10min)
10µLのDEPC処理水に溶解
吸光度測定
RNA濃度=0.197µg/µL

それからいつも通り逆転写反応とPCRをかけました。
Ct値は約25と大幅に高くなった。

考察した問題点と解決策
・回収率が約30%しかないしトータルRNA量としても少ないのでRNA必要量を6µgから12µgに増やした。RNAの濃度が低い時に希釈時にトータルRNA量を調整してはいるが前回も高いCt値を示したことがあったので。
・-80℃放置の時間が足りなかったので30minから1hまで放置した。
・遠心分離の時間も15minから30minに増やした。
逆転写酵素が古い可能性があったため新しいものを使用した。

以上のことをすべて行った結果Ct値が約20.4まで下げることには成功したが最初に測定したCt値約18.5との比べると再現性がとれていたとは言い難い結果になってしまった。

長くなってしまいましたが、他にどのようなことを行えばCt値がもっと下げることができると思いますか?

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