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(無題) 削除/引用 No.8574-5 - 2020/03/05 (木) 15:29:03 - ぬんた 返信遅くなってしまい申し訳ありません。 質問させていただいたシークエンスについては、別の仕事がありしばらく放置していたので、まだ読めていません。 研究室が組み換え生物を扱えず、クローニングは難しいです。。 なので、検体の洗浄とプライマーの位置を検討してみようと思います。 ご回答いただいた方々、この度はありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8574-4 - 2020/01/21 (火) 21:29:45 - おお プライマーブラストなどでどんな生物のものが引っかかるか見てみてもいいかも。 培養とか数日生かしておけるコンディションがあれば抗生物質を加えた培地を頻繁に交換しながらコンタミした菌を除去するとか、、、 よく洗浄してメスなどでなるべく内部の組織をとるとどうだろか・

(無題) 削除/引用 No.8574-3 - 2020/01/21 (火) 09:19:17 - ちき うどんげさんの提案に同意ですが、コンタミしている微生物の数によっては、サンガーで数クローン読んでも目的のシーケンスが得られない可能性もありますね。NGSでアンプリコンを読めればいいのですが、比較的簡単にできることとしては、DNA抽出の前に念入りに洗浄する、可能であれば軟体動物門内でのみ保存されている領域にプライマーを設定するなど、でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8574-2 - 2020/01/21 (火) 08:02:44 - うどんげ およそあらゆる動物のミトコンドリアDNAからCO1遺伝子領域650bpが増幅されてくるのですね。ではシングルバンドに見えて二種以上が混ざっていることになります。それ以外のエラーでもシークエンスを読むことで解決しそうです。PCR産物をベクターにサブクローニングして１コピーのクローンを選択しプラスミドを鋳型にして８クローンくらい読むか、次世代シークエンスで読むかすればどうでしょう。

腐敗サンプルのバーコーディング 削除/引用 No.8574-1 - 2020/01/20 (月) 16:24:32 - ぬんた DNAバーコーディングについて教えてください。 今回若干腐敗した軟体類のサンプルを用いて、CO１のダイレクトシーケンスを行ったところ、 波形が重なってしまい全く読めませんでした。 PCRの時点では、プライマーダイマーはあるもののシングルバンドのようなのですが、どのような原因が考えられますでしょうか。 腐敗していることで、増殖したバクテリア等の配列を拾っていることはありますか？ サンプルの腐敗は臭うくらいで、ぐちゃぐちゃになっているわけではなく、はっきりとした肉片の状態です。また、他種ですが新鮮なサンプルでは読めています。 なお、CO1の別領域にプライマーを設計しても同様に波形が重なってしまいました。 PCR産物はExoSAP-IT Expressを使用して精製しています。 電気泳動ではシングルバンドのようですが、視認できないほどの非特異産物がシークエンスに影響することはあるのでしょうか。 とりあえず切り出しすればよいかとも思ったのですが、職場が気軽にシークエンスをかけることができない環境なので、次回は成功させたく、何か改善策をご教授いただければ幸いです。 よろしくお願いいたします。

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