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(無題) 削除/引用 No.8593-4 - 2020/01/26 (日) 10:36:34 - ちき エッセンシャルかどうかが不明の場合、プラスミドで野生型アレルを持たせておいてから染色体上の遺伝子をいじるのがひとつの定法ではあると思います。

(無題) 削除/引用 No.8593-3 - 2020/01/25 (土) 07:57:55 - おお あ、そうそうその遺伝子が生育に必要なものであれば、欠失より変異体に入れ替えたほうがいいかもしれないね。

(無題) 削除/引用 No.8593-2 - 2020/01/25 (土) 05:27:21 - おお ターゲットの遺伝子が生育にエッセンシャルなのでは？

変異体の作製 削除/引用 No.8593-1 - 2020/01/24 (金) 17:00:07 - ぴっぴ こんにちは． ご覧いただきましてありがとうございます． 私は，グラム陰性細菌の遺伝子欠失変異体の作製を行っております． 方法は，プラスミドに標的遺伝子の上流と下流それぞれ500bp，抗生物質耐性,sacBをクローニングしたものを，細菌に形質転換し，相同組換えによりゲノム上に挿入したものを抗生物質耐性により選択しています． 得られた組換え菌をスクロース存在下で，培養することで自滅遺伝子sacBを脱落させ，2回目の相同組換えを起こすことで，野生型に戻るものと標的遺伝子が欠失するものとが理論上50%の確率で得られることにより変異体を作製する流れです． PCRによる確認で，1回組換えまではうまくいくのですが，2回目の相同組換えの際，理論上50%の確率で欠失変異体を得られるのですが，野生型にしか相同組換えが起こりません． 助言等ありましたらよろしくお願い申し上げます。

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