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ウエスタン陰性の細胞で蛍光免疫染色 トピック削除
No.8653-TOPIC - 2020/02/15 (土) 09:40:31 - JM
とある細胞のライセートのウエスタン(デタージェントで溶かしたサンプルと、不溶のペレットをSDSバッファーで溶かしたサンプルをパラレルで流しました)で、目的タンパクの発現が陰性(というか、測定限度未満、ポジコンはあきらかに陽性)と結論した内容を含む論文を投稿したのですが、査読が返ってきて、

「ウエスタンのみで陰性と判断するのはおかしい(実際にはweirdと書かれていました)、蛍光免疫染色と共焦点顕微鏡で確認せよ」とのコメントをもらいました。

mRNAのデータも入っているのですが、陽性の細胞と比べた相対値(1/100から1/1000の間)になっており、完全に0ではありません。

何点か、みなさんのご意見をお伺いしたいです。

(1)ウエスタンと比べて蛍光免疫染色・共焦点顕微鏡観察の方が感度が高いと一般化できるのか否か?
(2)ウエスタンで陰性の細胞において、免疫染色で陽性シグナルが見られた場合、非特異染色の可能性を否定できず、データにできないのではないか?
(3)ノックアウトの細胞をネガコン、過剰発現した細胞をポジコンとして免疫染色の条件設定を行い、その条件で共焦点顕微鏡観察した結果が陰性の場合、それで陰性と結論できるのか?

宜しくお願いします。
 
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5件 ( 1 〜 5 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.8653-5 - 2020/02/16 (日) 06:01:37 - おお
weirdと書かれてたりと、Reviewerの真意はやり取りや原稿を見てみないとなんとも言えません。また見てもわからないのかもしれませんけど。

もし本人を含め検出できている人がいるのかもしれません、(論文を書く上でいろいろ調査していると思いますが)もう一度発現という視点で検索し直して、もし見つかるなら結果の違いがなぜ起こっているのかなど考察してみるといいでしょう。


>微弱なシグナルの有無を判断するための条件設定は難しく、きちんと判断できる気がしません。査読者の方に寄せて「非常に弱いシグナルを検出」と結論すれば、論文が通る可能性は高まると思いますが、それが科学的に正しい事なのか、自信がないです。

すでに実験をやっているようですので、データーを示すがその点では結論は出さないくらいでもいいかもしれません。おそらくその細胞で発現が非常によわく、それに伴う生物学てき現象を見ているのでしょうから、発現に関しての詳細は論文の主張には、免疫染色のデーターは論文にあまり影響はないでしょうから。なのでありのままにデーターを出しておけばいいのではと思います。

(無題) 削除/引用
No.8653-4 - 2020/02/16 (日) 00:28:44 - まっくろん
  標的の量が少ない時、免疫沈降で濃縮してから検出するのを見たことがあります。抗体の性能が良いようなので、実験としては可能かもしれません。「無い」証明は極めて難しいことですが、「ここまでやっても駄目だよ」のを示すための候補の一つとして。

(無題) 削除/引用
No.8653-3 - 2020/02/15 (土) 23:43:50 - JM
1さん、どうもありがとうございます。おそらく査読者の意図としては、ご指摘いただいたように、細胞内局在により局所であれば検出できるが、ウエスタンでは検出できない場合があり得るので、免疫染色をやりなさい、という事だと思うのですが、査読の文面上は、「ウエスタンのような検出感度が低い方法で判断するのは信じられない」くらいの感じだったので、気になってしまいました。他のポイントも合わせ考えると、この査読者は、細胞内にそのタンパクがあるはずだという立場からコメントされていると思います。私もあるだろうとは思いますが、検出できるレベルかどうかについては、実験結果から結論するよりありません。

リバイスですので要求された実験を行なっていますが、免疫染色では一部のオルガネラで非常に弱いシグナルがあるかないか、くらいの感じになっています。質問の(3)と絡むのですが、コンフォーカルの設定で、ポジコンでシグナルが飽和しないレベルに合わせると、免疫染色のシグナルは完全に消えます。ノックアウトの細胞でバックグランドがほぼ消える設定(ポジコンは完全に飽和)だと、弱いシグナルがかろうじて見える細胞があるのですが、ノックアウトのコントロールでも注意深く見ると同じようなシグナル(抗体抜きのサンプルとの比較から、自家蛍光の可能性が高いと考えています)を持つ細胞が低頻度見られます。ノックアウトでこれが完全に消えるところまで閾値をあげるとサンプルでも消えます。細胞間、あるいは細胞内でもオルガネラによって、バックグランド蛍光のレベルがばらつくため、微弱なシグナルの有無を判断するための条件設定は難しく、きちんと判断できる気がしません。査読者の方に寄せて「非常に弱いシグナルを検出」と結論すれば、論文が通る可能性は高まると思いますが、それが科学的に正しい事なのか、自信がないです。

抗体については、ウエスタンでも免疫染色でもポジコンが綺麗にワークしているので、サンプルの変性や固定により決定的な影響を受ける事はないと考えています。

(無題) 削除/引用
No.8653-2 - 2020/02/15 (土) 19:25:53 - 1
発現レベルが、細胞集団内でだいたい均一ならば、一般論としては感度はwestern blottingのECL検出の方が蛍光抗体染色よりも良いように思いますしwesternでは分子量情報も加わりますから感度および特異性の点でもメリットはあるように思いますので、westernでは検出できないがIFでははっきり染まったとか、検出面でIFがwesternにまさる(ていうか両者はもともと目的が違う実験だし)ことはあまりない気がします。ただ、少数ながら変性した抗原とは反応しない抗体も時々ありますのでその分子の発現の有無が研究内容を大きく左右するならばwestern blotting以外の方法で見ることは大切かもしれません(でもそういうことは抗体の添付書類に書いてあるのでこれもあまり問題の原因にはならないですが)。

組織などでは非常に限局した部域とか特定の細胞にのみ高発現しているような場合、Westernのように組織ごとホモジナイズせざる得ないような実験だと発現のない部域・細胞のタンパク質で希釈されて試料中の相対的割合が激減して見えなくなってしまうことがあります。このような方法上の欠点を補完するため、組織化学的手法(IFとかIHC)と合わせて行うということはスタンダードなやり方となっています。培養細胞の場合でも、個々の細胞で発現レベルが異なるとかいう可能性があれば、(ある特定の反応を呈した細胞のみで発現するとか、ある特定の細胞周期で発現するとか、一過的な強制発現系で発現レベルが個々の細胞間でかなり不均一とか)Westernでは低く見積もる可能性があるので、そのミスを回避するためにもIFでも見ておくことは大切かもしれません。
抗体によっては抗原認識部位の関係で、westernでは使えてもIFとかIHCでは使えないもの、使えても固定法とかが特定の方法や条件でないとうまくいかないものもしばしばあるので添付書類などをあらかじめよく確認ください。

どのような方法でも、検出感度とか検出限界があるので厳密にいえばどンな方法でも発現していないとは結論できないし、実際、この細胞がこんなタンパク質を?みたいに意外な分子が低いレベルで発現していたりすることはあるので、正確には発現は検出限界以下のレベルとかそいういう表現をすべきなのかもしれないですね。

レビュアーも多くは公正無私ではないのでどうしても普段自分たちが主要な研究手法としている愛用している方法に肩入れしたくなるのは仕方ないので、彼らが『うちらは普段そうやってるし、当然するべきだろ普通に」と考えることが見当たらないとついweirdと感じるのはよくあります。指摘が本質的なことではないと思ったら、きちんと説明すればいいだけです。

ウエスタン陰性の細胞で蛍光免疫染色 削除/引用
No.8653-1 - 2020/02/15 (土) 09:40:31 - JM
とある細胞のライセートのウエスタン(デタージェントで溶かしたサンプルと、不溶のペレットをSDSバッファーで溶かしたサンプルをパラレルで流しました)で、目的タンパクの発現が陰性(というか、測定限度未満、ポジコンはあきらかに陽性)と結論した内容を含む論文を投稿したのですが、査読が返ってきて、

「ウエスタンのみで陰性と判断するのはおかしい(実際にはweirdと書かれていました)、蛍光免疫染色と共焦点顕微鏡で確認せよ」とのコメントをもらいました。

mRNAのデータも入っているのですが、陽性の細胞と比べた相対値(1/100から1/1000の間)になっており、完全に0ではありません。

何点か、みなさんのご意見をお伺いしたいです。

(1)ウエスタンと比べて蛍光免疫染色・共焦点顕微鏡観察の方が感度が高いと一般化できるのか否か?
(2)ウエスタンで陰性の細胞において、免疫染色で陽性シグナルが見られた場合、非特異染色の可能性を否定できず、データにできないのではないか?
(3)ノックアウトの細胞をネガコン、過剰発現した細胞をポジコンとして免疫染色の条件設定を行い、その条件で共焦点顕微鏡観察した結果が陰性の場合、それで陰性と結論できるのか?

宜しくお願いします。

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