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(無題) 削除/引用 No.8689-23 - 2020/03/08 (日) 18:58:04 - qpcr a様 Template→Mixなのですね。 やはり私の身近にいないだけでしたね。 使用器具をわけているから普段は手動、ですか。 分けますよね。 SYBR master様 ありがとうございます。 チップですか、チップに吸着しているというのは、正直あまり考えていませんでした。 （cDNAを保存するチューブはへの吸着は少し疑ってはいましたが・・・ かといって別に何もしてはいないのですが・・・） 使用しているギルソンのピペットへのフィット感と、 吸い出した際のチップへの見た目上の溶液の残り具合で、 チップは選んでいました。 今はwatsonの120P-207CSですね。 低コピーのRNAの際には、参考にさせていただきます。 Pipettyレンタルしてみました。 初めて電動マイクロピペット触ってみましたが、 確かになれれば便利そうな感触でした。 ただ、若干使いにくい様な気がしました。 吸うと吐くが同じボタンというのは、 個人的には使いにくい様な・・・。

(無題) 削除/引用 No.8689-22 - 2020/03/06 (金) 17:45:13 - SYBR master ちょっとだけ毛色が違う話をします。 バラツキが頻繁に起きているとき、特にターゲットが100コピー以下の時に、DNAがチップに吸着しているのでは無いかと考えて、ARTのLow Retention製品を使うようになってから、そこの部分でのバラツキがかなり小さくなったことがあり、もっぱらそれを利用していました。 ただ微妙にランニングコストは高くなるので、現在学生・院生にはARTではなく、Tarsonsという会社のLow Retentionを、普段は使用してもらっています。 Excellに落とした過去データが今読み込めない（MO driveってまだ売っているのかな)ので、Ct値が数字としてどれぐらい良くなったかは直ぐには解りませんが、増幅プロットのカーブがほぼ一致するくらいには良くなっているようです。個人的には0.2以下程度ならduplicateでも許容範囲内だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.8689-21 - 2020/03/05 (木) 12:51:23 - a あくまでも私の使用感ですので templateを1uLずつ分注するのにGILSONが使いやすかったというだけです 2uLずつの分注ならPipettyで問題ありませんでした 普段は手動というのは単純に使用器具を分けているからです あとは20uLの系（template：2uL）なら手動で問題ないからでしょか 電動ピペットを使うときは、template：1uLをwellに入れてからmix：9uLを入れています それぞれ電動ピペット使用です

(無題) 削除/引用 No.8689-20 - 2020/03/04 (水) 14:56:23 - qpcr TS様 コメントありがとうございます。 手動の理由について、承知しました。 電動は持っていないのですが、正確なら楽らしいのでいいなぁ、と思いました。 お金があれば・・・誰か〜。 入れる順番についてですが、 cDNAをプレミックスで流せて、混和の点でよいのかも？と想像していました。 初耳だったのは、私の世界が狭いだけだと思います。

(無題) 削除/引用 No.8689-19 - 2020/03/04 (水) 13:31:12 - TS メトラトレドはいわゆるレイニンです。 発売当初は、カラー液晶画面が付いている製品が他にあまりなかったし、 レイニンはたぶんそれなりのシェアがあって信頼できるところと思います。 使い勝手も悪くないです。 PCRに使ってないのは精度の問題ではなく、手動でも問題ないかなと思っているのと、個人的には手動の方がお手軽だからです。 手動でも、リバースピペッティングを正しくしていれば、分注作業でそんなにばらつかないと思うんです。 cDNA-->premixの順番は逆でもいいんですが（そんなに珍しいかな）、 この順番の方がどのチューブまで作業したかを見失わないためです。

(無題) 削除/引用 No.8689-18 - 2020/03/04 (水) 13:15:47 - qpcr a様 電動ピペット（ギルソンなら？）楽でぶれにくいのですね。 Pipettyの情報、ありがとうございます。 機構上（？）ぶれにくいとHPには書いてありますが、 （Ct値のばらつき等で評価） そこまででもないという印象なのでしょうか。 ちなみに、電動も持っているのに、普段は手動というのは、なぜですか？ TS様 メトラトレド：知りませんでした。 良い感じでしょうか？ 電動ピペット持っていないので、使用していないのですが、 もし使用するなら、TS様のおっしゃる通り、 プレミックスを分注して、cDNAをアプライしていくつもりです。 というか、いつもその順番にアプライしています。 TS様パターンは初めて伺いました。 ちなみに、電動ピペットをqPCRに使用していないのは、ぶれが大きいという事でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8689-17 - 2020/03/04 (水) 10:45:52 - TS あ、文字化けしましたね。すみません。 （3µL)>>3マイクロリットル （12µL）>>12マイクロリットル （15µL）>>15マイクロリットル です。

(無題) 削除/引用 No.8689-16 - 2020/03/04 (水) 10:43:53 - TS 色々参考にさせていただいております。 電動ピペットはメトラトレドのをもっているのですが、qPCRには使っていません。 定量PCRで電動ピペットをお使いの方に伺いたいのですが、どのように使われているのでしょうか。 当方では、各試料由来のcDNAをチューブに分注した後（3µL)、プレミックス（プライマー、PCRマスターミックス、水）をすべてのチューブに連続分注（12µL）していきます。すべて手動のピペットです。合計15µLでPCRにかけています。 もし私が電動ピペットを導入するとすると、プレミックスの連続分注かなと想像しています。そうすると、多少は精度が向上するかもしれないのですが、結局cDNAを手動ピペットで分注するときにばらつきが出るのではないかと思っています。 ご教授いただけると幸甚です。

(無題) 削除/引用 No.8689-15 - 2020/03/04 (水) 09:53:01 - a 必要に迫られて電動ピペットを使い始めたのですが、想像していた以上に楽でした トリプリ3群比較で96wellやってもぶれないのでありがたいです（total:10uL） 普段は手動です（total:20uL） 今はGILSONの電動ピペットを使っていますが、GILSONのピペットに純正チップが一番使いやすいかなと total:20uLの系だとPipettyでも問題なかったのですが、Pipettyならメーカー推奨のチップよりもGILSONのチップの方が使用感はいいかなと思っています 推奨のはやわらかいのがあんまりすきじゃなかったので あと、Pipettyは使い方がちょっと独特で好みがあるかもしれません メンテと校正は業者任せです

(無題) 削除/引用 No.8689-14 - 2020/03/03 (火) 11:26:39 - qpcr a様 コメントありがとうございます。 普段手動なのですが、pRCRでみなさまは電動ピペット使用していらっしゃるのでしょうか？ 電動を持っているラボにいたこと無くて、それが普通なのか分からず・・・。 確かにPipetty安いですよね、使用していらっしゃいますか？ 地方だからか、評判がわからないのですよね・・・。 使いやすさとか、実際のところの正確性とか、メンテナンスとか、いろいろ。

(無題) 削除/引用 No.8689-13 - 2020/03/03 (火) 10:57:39 - a 根本的な解決にはならないですが、電動ピペットを使ってみたらどうですか pipettyとか安いですし 仮に手技的なものでどうしてもぶれているのだとしたら、改善されるのではないでしょうか

(無題) 削除/引用 No.8689-12 - 2020/03/03 (火) 09:08:00 - qpcr うの様 ノートをご確認いただき、ありがとうございます。 ＞変性時間による改善効果が得られたのは少なかった そうですか、でもあるんですね、10分OKなのですね。 Primer濃度も基本ですよね、ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8689-11 - 2020/03/02 (月) 20:42:40 - うの > これはHot startのための最初の変性時間 そうです。 けどノートを見返したら、変性時間による改善効果が得られたのは少なかったので プライマーと相性のいいマスターミックスを見つけるのが良いと思います。 あとはプライマー濃度を3-5倍程度で振ってみるくらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8689-10 - 2020/03/02 (月) 13:40:57 - qpcr 太郎様 自身のデータと比較していただき、ありがとうございます。 少し過剰にとらえていた部分はあるのかもしれませんが、 実験系に問題はやはりあるのだろうと思っています。 PCRの温度・時間の再検討は必要度が高いと思っています。 （冷静になればここから疑うのが当然ですよね。） cDNAは2uL（その他のMixture 16uLに添加し、Total18uL）で行なっています。 cDNAは転倒混和・タッピングですよね。 Thermo（だったと思う）のサイトで、1sec vortexというのを見て、 VortexしてOKなの？と思いまして。 mixture調製は常温なのですね、参考になります。 うの様 私は現在、Thunderbird SYBR qPCR Mixを使用しています。 安い方かなと思っています。 変性時間1min or 10minという事ですが、 これはHot startのための最初の変性時間、という事ですよね？ （40サイクル回している最初の熱変性ステップではなく。） ご提示いただいた2つの説明書では1分の様でしたが、 10分やっても大丈夫なのですね。 ちなみに、10分の方がいいパターンもあったのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8689-9 - 2020/03/02 (月) 12:29:32 - うの > 他のMaster mix 私はプローブ法ですけど、たいていはToyoboのRealtime PCR Master Mix、Thunderbird Probe qPCR Mixでいい結果ですね。 上記のSYBR法に対応するMaster Mixを試してみては如何でしょうか。 あと、タカラバイオからもいくつか売られているので、試してみるとか。 ちょうどキャンペーン中ですし。 二種類のMaster Mixと、変性時間を1分 or 10分の４パターンの組み合わせで たいていのプライマー（プローブ）のCt値が揃ってる感じです。

(無題) 削除/引用 No.8689-8 - 2020/03/02 (月) 11:01:12 - 太郎 3重測定(SYBR, primer, 水を混ぜた溶液を試料数分まとめて作って各ウェルに分注し、同一cDNAを個別ウェルに追加)のデータが4つ手許にありました。 (平均値 +- 標準偏差) 形式で表示したものが下記になります。 17.28 +- 0.09 17.22 +- 0.04 5.19 +- 0.08 5.36 +- 0.17 感想をいくつか。 Ct値が0.2ばらつくことはそれほど気にすべき問題ではないように思われます。ただし、2重測定でCt値が0.6異なることはめったにないことであり、自分なら実験系に問題ないか気にします。 Ct値が大きい場合(つまり標的量が少ない場合)は、ばらつきが大きくなりがちだと思われます。29.13 +- 0.16 というのはそれほど悪くないのではないでしょうか。 cDNAを2uLとか5uLとか容量を多めにしたらばらつきが小さく出来そうな気がします。("SYBR, primer, Template全てを1つのTubeで混ぜて、そのまま分注" する場合でなく、通常のduplicate測定の場合のはなしです。) その他 cDNAはボルテックスはしませんが、転倒混和もしくはタッピングでよく混ぜています。 試薬類は氷上に置きますが、分取して作る反応用液は常温に置いています。 TOYOBOなら、1mLx5本で37000円のものより、1.67mLx3本で29000円の方が費用対効果が高そうな気がします。きちんと比較したわけではない憶測ですが。

(無題) 削除/引用 No.8689-7 - 2020/03/02 (月) 09:50:47 - qpcr うの様 ありがとうございます。 Ct値0.14以内ですか、初めてのパターンです、参考になります。 プレートの端は使わない、は確かに聞いたことあります。 私の場合、端がダメというわけでもないような・・・ （何度か試した傾向として中央寄りと端よりで異なる雰囲気はあるのですが、 絶対的なものでもなく、隣のWellで離れている場合もあるので。） おっしゃる通り、他のMaster mixは試してみたい気もしていますが、 あまり強い根拠は持てていません。 ちなみにどこのどれを使用していらっしゃいますでしょうか？ PCRの温度条件ですね。 言われてみると非常に基本的なところですね。 先人から引き継いで信じていた部分でした。 見直します、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8689-6 - 2020/03/01 (日) 19:40:01 - うの 私はCtのブレを0.14以下(2^0.14=1.10で定量値のばらつきが10%以内になるので)を目指してます。 実際は0.2以下で妥協していることも多いですけど。 プレートの端は値がブレることが多いので（機器によると思う）、そこは使わないとか。 プライマーとマスターミックスの相性が悪いかもしれんので、他のマスターミックスを試してみる。 もしくはPCRの条件が合ってないのかも。 1st stepの変性時間を変えてみては？

(無題) 削除/引用 No.8689-5 - 2020/03/01 (日) 14:57:28 - qpcr ノリツッコミ様 他の人と比べると、 自分が一番マシな方です。 小さなラボで、データを見せてもらった人は二人とか（やってる人全員）ですが。 過去ログは一通りは確認したつもりです。 ｗｗｗｗ様 0.2は問題なしですか？ 例えば、DuplicateでCt値が15.2と15.4という意味です。 （たまにもっと離れたものがでてくるのですが） ちなみに普段はどんな程度ですか？ おお様 分かりにくい文章で、大変失礼いたしました。 同一cDNA由来のデータの誤差について、質問しております。 なお、普段はDuplicateの平均で、結果を出すようにしています。 Triplicateの方が正確でしょうが、Well数の都合上、行なっていません。 同一条件で別個体のラットからのデータのばらつきは、 今回は問題にしてはおりません。（悩みの種であることは確かですが。） すべて同じMixtureを96wellすべてにいれて、確かめてみました。 （SYBR, primer, Template全てを1つのTubeで混ぜて、そのまま分注しただけ） やはりばらつきがあるようです。 Ct値の平均が29.13サイクル、SDが0.156、Minが28.81、Max29.56でした。 （Actbではないです。） 複数回行なってみましたが、 なんとなく中央下あたりがCt値が小さく、Plateの端の方が高い様な傾向はありましたが、 毎回同じ部位というわけではないようです。 別の機器でも一度だけ行ってみたのですが、 だいたい似たような結果でした。 Takara bioには以前上記のデータを送って問い合わせてみてはいたのですが、 多少機器性能としてのばらつきの範囲を超えているかな？という回答で、 とりあえずランプを交換して、キャリブレーションをかけてみては？ダメならまた連絡して？ と、いうことでした。 機器としてのばらつきをどの程度と想定しているかとの質問には、 まったく答えていただけませんでした。 上記を総合すると、機器に原因がないとは言えないが、多くがあるというわけではないかな、と思っています。 ピペットの洗浄についてですが、 水の重量については、測定していました。 誤差範囲内の様でしたが、数カ月洗っていなかったので、 ついでに位の気持ちでした。 思いつく原因をまず多くリストアップして、原因としてありそうな順と、解決策として出来ることを並べようかと思い、質問させていただきました。 冷静になって、改めて考えてみようと思います。 ありがとうございます。 ご多忙と思いますが、引き続き、既に上げさせていただいたRNAやcDNAを扱ううえでの基本的な事項（広い意味での腕？）等を含めて、広くご指摘いただけますと、幸いでございます。 なにとぞよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.8689-4 - 2020/02/29 (土) 04:16:36 - おお ちょっとそれぞれの問題提起に対して冷静に考えてくださいよ。。。 ＞96well plateの離れたところだと、Ct値が離れやすい様です。 だったらそれぞれの位置によるバリエーションの問題だからCalibrationするとか、他の人で同じような傾向があるか協力してデーターを集めるて本当にWellの位置による問題なのか結論を出す必要があるでしょう。もしそうなら他の解決方法はどれだけ意味をなすのか。 ちなみに Applied Biosystems brand real-time PCR instruments have an instrument performance specification maximum cut-off of 11% CV. thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/gene-expression-analysis-real-time-pcr-information/precision-qpcr.html もちろんあなたのマシーンについてSpecificationがどうなっているのかなど確認されるべきでしょう。 ＞Actbを検出したところ、0.2程度異なる 同じcDNA（のチューブ）から生じる誤差なのか、同じRNAから別個にRTしたチューブから生じる誤差なのか、同じ条件で同時に行った違うDishからのRNAから生じる誤差なのか（培養細胞のばあい）、同じ条件で違う日にやった実験の誤差なのか？ ちなみに数個体のラットからのRNAで見られる誤差については https://peerj.com/articles/855/ 私はピペッティングの誤差はほぼ全体的に１０％と思っているのでそれによるCt値の変化がどれくらいかも考えてみるべきかと思います。 たとえば、 pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx? thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/real-time-pcr-troubleshooting-tool/snp-genotyping-troubleshooting/trailing-clusters/pipetting-errors.html ＞ピペットの洗浄は行うつもりでいます。（少なくとも見た目上アプライ量の誤差はなさそうに見えますが、念のため。） 自身のピッペッティングの誤差などは吸い上げた水などの量をはかりで調べればわかります。面倒なら業者がクリーニング、Calibrationのサービスをしています。洗浄したからちゃんと測れるようになったと自身でどのように結論づけるのか。洗浄したけどやっぱりピペット？とか堂々巡りになる可能性について考えたことがあるのか疑問です。 また、統計的な理屈でいえば１ Wellで値を求めるのと複数Wellで平均を取るのでは後者のほうが正確性が高くなります。それをどの程度考慮していらっしゃるのか。

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