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(無題) 削除/引用 No.8710-10 - 2020/03/09 (月) 10:26:55 - おお あなたの解析から転写されているのでしょう。で何を助けたらいいのか、、、 結局はその蛋白ができないことによる現象が見れていればそれ以上でもそれ以下でもないと思いますが（もし転写開始点に研究の興味があるのでしたら別ですが）。 転写開始点は遺伝子によって複数ある場合もあるし、クリプティックに生じることもあるかもしれませんから白黒つくような見方でテンパるのはどうかと思います。場合によっては遺伝子の反対側から裏のDNA配列が読まれているかもしれません。 ＞もし、オルタナティブスプライシングが血管内皮にて起きているのなら、マウスの表現型が弱いことを説明できます…た オルタナティブスプライシングと言えるかどうかわかりませんが、マウスの表現型が弱いのでExon2以降からTranslationで蛋白ができているかもしれないという考察はかけると思いますがそれではだめなんでしょうか。 ちなみにmRNA量が反映できるような系でPCRしてますか？

(無題) 削除/引用 No.8710-9 - 2020/03/09 (月) 09:37:50 - まっくろくろすけ どうか、おたすけください...

(無題) 削除/引用 No.8710-8 - 2020/03/09 (月) 01:02:23 - まっくろくろすけ すみません、言葉足らずでした。 エクソン1には、転写開始点から開始メチオニン以下までがfloxされており、Creでその部分が除かれていることは確認できましたが、それでもプロモータがインタクトなので、mRNAは発現して然るべきでしょうか？ 転写開始点がなくてもmRNAはできてしまうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8710-7 - 2020/03/09 (月) 00:28:57 - まっくろくろすけ 今データを見直しましたが、エクソン1には転写開始点までも含まれています。 ですがやはり、この場合でもmRNAは転写されてしまうものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8710-6 - 2020/03/08 (日) 15:28:04 - まっくろくろすけ APさま ありがとうございます。 はい、forwardはエクソン1に、リバースは敢えてエクソン2に設計しており、ゲノムは20kbpで、cDNAは200bpになるようにしています。 抗体を探してみましたが、C末を認識するいい抗体は無いようでした。 N末を免疫原にしてる論文を見つけたのでn末を認識するものはありそうです。

(無題) 削除/引用 No.8710-5 - 2020/03/08 (日) 13:29:37 - AP こういうことするとき、イントロンを挟んだPCRデザインにするのが定法でしょう。

(無題) 削除/引用 No.8710-4 - 2020/03/08 (日) 13:24:52 - AP 単一エクソン内でPCRをかければ、増幅産物がcDNA由来でも夾雑しているゲノムDNA由来でも、同じものが同じように検出されますが、その点はクリアしているのだろうか？ RNAサンプルからDNAを完全に除去するのはほとんど不可能。せいぜい実験結果に影響しないレベルまで減らすことしかできません。それが達成できているというのは確認済みですか？ 極端な話、RNAがなくったって、RTが失敗していたって、夾雑ゲノムDNAで今回と同じ結果になりえる。

(無題) 削除/引用 No.8710-3 - 2020/03/08 (日) 12:51:01 - まっくろくろすけ APさま なるほど！そういうことだったんですね！ プロモーターは生きている、というところで府に落ちました。 恥ずかしながら考えが及びませんでした。 ならばC末を認識する抗体でN末欠失のタンパク質ができているかどうかを確認しなければなりませんね。 ありがとうございました。とても勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.8710-2 - 2020/03/08 (日) 12:30:19 - AP > するとエクソン1内に設計したforwardプライマーを使ったqRT-PCRではバンドは野生型マウス(unfloxedマウスのcDNA)のサンプルにのみ認められました。ところが、エクソン7に設計したforwardプライマーでqRT-PCRを行うと、予想に反して野生型マウスと変わらずの遺伝子発現でした。 exon 1や翻訳開始メチオニンを欠損させても、転写プロモータは生きているのだからmRNAは転写され、欠損していないexon 7のPCRはかかる。当然の結果ですね。 NMDでmRNAの分解が促進して、変異を持つmRNAの量の減少が観察される場合もありますが、転写自体の影響ではありません。 機能的な翻訳産物ができるかどうかは別の問題。 in-frameのメチオニンコドンからN末端を欠損したタンパク質ができて、それがある程度、機能を保持してるという場合もあります。

exon1の欠失にも関わらずの遺伝子発現 削除/引用 No.8710-1 - 2020/03/08 (日) 11:58:03 - まっくろくろすけ この度はお世話になります。 いつも勉強させていただいております。 私はCdh5Creを用いて、血管内皮細胞において興味対象の遺伝子をノックアウトしたマウスの解析を担当しています。 予想に反して、表現型が予想に反して極めて弱く、その原因を探索していました。 遺伝子は7つから成り、第一エクソンには5'UTRと開始メチオニン以降が含まれています。そしてエクソン1が丸ごとfloxedしており、mTmTマウスとの掛け合わせから、内皮細胞ではCreによる組替えが起きていることは確認しています。 私はまずCD31陽性細胞をソーティングし、mRNA抽出しました。 するとエクソン1内に設計したforwardプライマーを使ったqRT-PCRではバンドは野生型マウス(unfloxedマウスのcDNA)のサンプルにのみ認められました。ところが、エクソン7に設計したforwardプライマーでqRT-PCRを行うと、予想に反して野生型マウスと変わらずの遺伝子発現でした。プライマーは特異的にバンドを増やしています。 これをそのまま解釈すると、エクソン1は確実に抜け落ちて入るけど、遺伝子は発現している、と考えるべきでしょうか？このfloxedマウスはJaxから購入したもので、別の細胞系譜においてfloxedタンパク質が欠失していることが論文にて報告されています。 もし、オルタナティブスプライシングが血管内皮にて起きているのなら、マウスの表現型が弱いことを説明できます…ただマウスの研究に詳しい方がいないので、ここでアドバイスをいただけたらと思い、トピックをたてました。よろしくお願いします。

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