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(無題) 削除/引用 No.8720-5 - 2020/03/15 (日) 20:26:02 - toto IRES-puroで割と遭遇します。puro濃度を上げるくらいでしょうか。cotraと変わらない程度という印象です。

(無題) 削除/引用 No.8720-4 - 2020/03/15 (日) 12:12:35 - クロちゃん ではそれが表現型なのかもしれませんね。 タンパク質分解が盛んに起きているのかもしれませんので、阻害剤を加えてどうか等の実験を計画されてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8720-3 - 2020/03/15 (日) 11:50:00 - あいれす ありがとうございます。 研究室で独自に改良されてきたもので、具体的な名前の開示はできないのですが何度も実績があるベクターになります。 遺伝子名も申し訳ありませんがご容赦ください。 ベクターの影響を確認するために mEGFP-C1 ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子Xを組み込んでみたこともあるのですが、こちらも293T細胞で　5%ほどの陽性率で、他の細胞株ではほとんど発現が見られません。

(無題) 削除/引用 No.8720-2 - 2020/03/15 (日) 11:38:50 - クロちゃん プラスミドの具体的な名前は開示できますか？

kozak付けても開始コドンが認識されない 削除/引用 No.8720-1 - 2020/03/15 (日) 11:22:01 - あいれす お世話になります。 ヒト培養細胞でEGFP蛍光標識した遺伝子を発現させる実験を試みています。 各種がん細胞株で安定発現株を得ることが目的です。 この度 CMVプロモーター - Kozak(GCCACC) - ATG-EGFP- 遺伝子X（ヒト由来 4500bp）- IRES- ピューロマイシン耐性 - polyA と、いうプラスミドを構築しました。 発現チェックのために、293T細胞にトランスフェクションしたのですが EGFPの発現が確認できるのは、生細胞全体の5%程度でした。 このままピューロマイシンをかけてみたのですが、EGFPが発現していないクローンが殆どを占めます。 乳がん細胞株や肺がん細胞株にも遺伝子導入を試みたのですが こちらはEGFP発現細胞が全く確認できませんでした。 ピューロ耐性株は取れます。 結論として、開始コドンが正しく認識されていないと考えています。 遺伝子Xの配列中にはkozakはありませんが、ATGは何か所もあります。 何か良い方法はありませんでしょうか。 お知恵を拝借できましたら幸いです。

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