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複数の遺伝子を発現させる最も良い方法は? トピック削除
No.8738-TOPIC - 2020/03/27 (金) 20:15:15 - Momoko
HeLa細胞で、4つの異なる遺伝子を同時に発現させたいのですが、IRES vectorがベストでしょうか?
よろしくお願いします。
 
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No.8738-5 - 2020/03/30 (月) 12:58:29 - asan
一番簡単なのは、4つの遺伝子をそれぞれコトラすることです。

別々の細胞に個別に発現するのでは?という人がいるかもしれませんが、通常リポフェクション等の方法では、ありえないモル数のコピーが一緒になって入るので、4つ混ぜた場合にそれぞれ個別に発現することはほとんどありません。

2AやIresなどをつなげたり、bidirectional promoter等で発現させることは可能ですが、それぞれのトランスクリプトの安定性などの違いで量比を揃えるのが難しいため、現実的には混ぜて入れるのが一番現実的な方法だと思います。

同じコピー数を同じ細胞にインテグレートさせたいとかそういう場合はこの方法だと難しいが、通常それならばレンチウイルスとかでやった方が早いと思います。

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No.8738-4 - 2020/03/28 (土) 14:36:34 - ウイルス
経験的に最も正しい答えは「やってみないとわからない」だと思います。IRES、2A も交互に入れるとか、前二つを IRES、後ろを 2A にするとか、根拠のない理由で発現が変わる場合があります。4つの遺伝子を発現させている例やご自身の遺伝子の複数を発現させている例を論文で見て、同じ方法か、それをベースにした方法でやってみるしかないと思います。可能なら2つくらい違う方法を試して、良い方法をとるのがより良いですが。。。

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No.8738-3 - 2020/03/28 (土) 05:17:20 - おお
dual expression vectorというのもあります。ほぼ左右対称に発現ユニットを持っていて、Transcriptionのレベルでは同等の発現量が期待できる用になっているようです。

IRES vectorは経験的に後ろは弱くなるような傾向があります。前の遺伝子の長さに依存するような気がしてます。そういう意味では2Aなどはベターかも知れませんがあまり経験がないので推測です。

蛋白の安定性なども加味すると、Transcriptionレベルで同等でも発現量に差がついてしまうでしょうし、その上でどの程度の差までが許容範囲かでもストラテジーが変わってくるかもしれません。

一時期ラボに来ていたポスドクは1つづつTransfectionして3つ、4つの遺伝子を前のラボで発現させてました。

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No.8738-2 - 2020/03/27 (金) 22:18:27 - コロナ
2Aです。

複数の遺伝子を発現させる最も良い方法は? 削除/引用
No.8738-1 - 2020/03/27 (金) 20:15:15 - Momoko
HeLa細胞で、4つの異なる遺伝子を同時に発現させたいのですが、IRES vectorがベストでしょうか?
よろしくお願いします。

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