全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.8772-10 - 2020/04/15 (水) 15:38:07 - 流しの研究者 >[Re:4] Hさんは書きました : > >[Re:2] 流しの研究者さんは書きました : > oligo dT primerは使っていません。 > なので何が起こっているかがさっぱりわからないのです。 私も、Hさんが、何をしているのかさっぱりわからないのです。 どういう反応なのか、もう少し詳しく書けませんか？

(無題) 削除/引用 No.8772-9 - 2020/04/15 (水) 15:24:56 - AP それとは別に、質問への回答だけど、 PCRのプライマーの3'側は、アダプター配列に対するプライマーですべてのcDNAに対して一斉にPCRをかけるわけだけれど、このPCRプライマーのオフターゲット、ミスアニールによって生じる非特異的な産物はありえます。 PCRが進んで鋳型濃度が高くなったときに、非正規の場所にプライマーがアニールして、truncateした産物が増幅したとか。

(無題) 削除/引用 No.8772-8 - 2020/04/15 (水) 15:18:52 - AP そのアダプタープライマーがoligo dTにアダプターが付いたもので、プライミングはoligo dTに他ならないんじゃないかい？ どんな名称がついているかじゃなくて、中身がどういうものか理解すべきじゃないかい。 >> 1. 逆転写反応はどんなprimerで行ったのか。 >Invitrogenのキットのアダプタープライマーおよび自分で設計したGSPを用いました。 「逆転写」のプライマーにアダプタープライマーとGSPを同時に使ったということ？　おかしいと思わない？　　 実験のデザインは頭に入っているのかな？ ポリAを利用してoligo dTプライミングしなけりゃ原理的に3' RACEなんてできないでしょ。 落ち着いてしっかり説明書を読んで理解する時間をとるべきじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8772-7 - 2020/04/15 (水) 14:37:01 - H >[Re:6] ちきさんは書きました : > なんかよくわかりません。 > > 1. 逆転写反応はどんなprimerで行ったのか。 Invitrogenのキットのアダプタープライマーおよび自分で設計したGSPを用いました。 > 2. PCRの3' primerは何を用いたのか。 InvitrogenのキットのUAPおよび自作のGSPです。

(無題) 削除/引用 No.8772-6 - 2020/04/15 (水) 14:18:20 - ちき なんかよくわかりません。 1. 逆転写反応はどんなprimerで行ったのか。 2. PCRの3' primerは何を用いたのか。

(無題) 削除/引用 No.8772-5 - 2020/04/15 (水) 14:11:18 - H >[Re:3] APさんは書きました : > oligo dTプライマーはpoly AでないA-richな配列からプライミングすることはよくあります。プライマー過多だとなおさら起こりやすくなるでしょう。 oligo dTプライマーは使っていないのです。

(無題) 削除/引用 No.8772-4 - 2020/04/15 (水) 14:09:36 - H >[Re:2] 流しの研究者さんは書きました : > gene specific primer使えば、polyAなくてもできると思いますけど。 GSPはRNAの3´側にアニールして5´方向にcDNAを合成しますよね？ それだと3´末端側が未知のままだと思います。 > > kit付属のoligo dT primerを使用ということでよろしいですか？ oligo dT primerは使っていません。 なので何が起こっているかがさっぱりわからないのです。

(無題) 削除/引用 No.8772-3 - 2020/04/15 (水) 14:01:25 - AP oligo dTプライマーはpoly AでないA-richな配列からプライミングすることはよくあります。プライマー過多だとなおさら起こりやすくなるでしょう。 oligo dTプライミングでcDNAライブラリーを作ると、rRNA由来のcDNAクローンがかなりの割合、混じってきます（oligo-dTカラムでpoly A+を濃縮したとしても）。rRNAのA-richな部分からプライミングが起こったということに他なりません。

(無題) 削除/引用 No.8772-2 - 2020/04/15 (水) 12:07:49 - 流しの研究者 >[Re:1] Hさんは書きました : > 3´RACEはpolyAテールを持つものにしかつかえませんよね？ gene specific primer使えば、polyAなくてもできると思いますけど。 > しかし、polyAがないものでもできていました。 kit付属のoligo dT primerを使用ということでよろしいですか？ > シークエンスで確認済みです。 > どのようなことが起こっているのでしょうか。 oligo dT primerを使っていれば、oligo dT primerにより逆転写が生じた、ということでしょう。

3´RACEについて 削除/引用 No.8772-1 - 2020/04/15 (水) 11:37:07 - H 3´RACEはpolyAテールを持つものにしかつかえませんよね？ しかし、polyAがないものでもできていました。 シークエンスで確認済みです。 どのようなことが起こっているのでしょうか。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---