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総蛋白濃度測定の簡便な方法 トピック削除
No.8838-TOPIC - 2020/05/10 (日) 18:01:18 - total protein conc
度々参考にさせていただいております。

培養細胞の総蛋白濃度を測定する、簡便な方法をお伺いいたしたく思います。
みなさまはどうされていますでしょうか。
目的は、別の測定項目(培地中の成分や、光らせた細胞の蛍光等)の補正に総タンパク量を使用したいためです。
Western等の他の検討には使用しません。
簡便で正確な方法だとありがたく思います。
ご教授いただけますと幸いでございます。

@RIPA buffer等で溶かす。
手間が多い。
A1N NaOHを培養細胞にかけて、30分以上OvernightOKで放置し、それをそのままBradford法等で測定する。
知人に伺ったのですが、自分で行うと値が多少ぶれやすい様で、困っています。
以上、よろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.8838-5 - 2020/05/12 (火) 21:00:11 - total+protein+conc
GG様
細胞数で補正ですか。
はがしてトリパンブルーでカウントですか?
それとも(おお様のご提案の様な)そのままかDAPIか何かで染色して、蛍光測定や写真をカウントですか?

RIPAを用事調整する、スクレーパーではがす(48wellや96wellに入るものが売っているのか?それとも不要か?後日顕微鏡をのぞいてみます。)、遠心するという点が、手間だなと、感じていました。勘違いがあるかもしれません。

説明書上、NaOHはたしかに0.1Nまでとなっております。
1N NaOHをBradford法のアッセイ溶液に入れ、BSAで検量線を書きましたところ、1N NaOHだけでも多少呈色はしましたが、検量線がちゃんと引けたこと、細胞数を振ってみたところ、だいたい想定通りでしたので、良しとしました。
NaClなら2.5NまでOKだそうですので、2N HClを加えて、中和したものにすれば、より安定したデータがでるかもしれません。
ご指摘ありがとうございます。


おお様
Hoechstで蛍光測定ですか。
ありがとうございます、考えたことがありませんでした。
青は目的の指標の測定で使用するので、PIで赤にすれば、良いのかもしれません。
だた、ふと思ったのですが、肝臓の様な核が複数含まれる細胞が混在している細胞の場合、補正として適切でしょうか。
私は単核の細胞に限るという事だろうと思うのですが、いかがでしょうか。

MTT系は、私も少し考えたのですが、実験的な介入でMTTが変わらないことが前提となるので、それを事前に調べておけばよいのでしょうが、手間が結局増えるのと、自信が持てなくなる気がして、今は採用していませんでした。
ご提案いただき、ありがとうございます。

ema様
ご提案いただき、ありがとうございます。
補正に使用するだけですので、できれば安価だとありがたく思います。
Direct Detect スペクトロメーター、勉強不足でしりませんでした。
残念ながら、当方所属の共有機器にはありませんでしたが、勉強になりました。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.8838-4 - 2020/05/11 (月) 09:19:55 - ema
お金がかかっていいならDirect Detect スペクトロメーターは比較的安定して測定できています。

(無題) 削除/引用
No.8838-3 - 2020/05/11 (月) 00:25:06 - おお
DNA量ベースで細胞量(数)を見積もる手もあるのでは?
https://www.biotek.com/resources/application-notes/dna-quantification-using-hoechst-33258/

たしかこの手の測定には高塩濃度でしょりしてDNAを均一にするんだけど中性のデタージェントで細胞がけんだくした状態でもはかれるし。

実際こういう論文もあるし。
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0014482785800525?via%3Dihub

接着した細胞をそのまま顕微鏡で取ってそのフィールドの細胞数を測るのも細胞が密じゃないとできるし、マニュアルでやっても最近の画像処理ソフトなどでも対応しているものがあるはず。

もっと簡単に済ますならMTTやWSTのCell counting kitなど。細胞内の生理活性を測っているという欠点があるけど。あと相対的で同時に測定しないと少しぶれが出て違うときにやったもので比較がどの程度できるのか不安。

(無題) 削除/引用
No.8838-2 - 2020/05/10 (日) 20:49:18 - GG
私は培地中の成分は、総タンパク質(抽出バッファーによって何が可溶化されるか変わります)ではなく、細胞数で補正しています。

RIPAの手間が多い、というのは良く分かりませんが、1N NaOHで抽出すると、10倍程度に希釈しないと定量できないのではないでしょうか。

総蛋白濃度測定の簡便な方法 削除/引用
No.8838-1 - 2020/05/10 (日) 18:01:18 - total protein conc
度々参考にさせていただいております。

培養細胞の総蛋白濃度を測定する、簡便な方法をお伺いいたしたく思います。
みなさまはどうされていますでしょうか。
目的は、別の測定項目(培地中の成分や、光らせた細胞の蛍光等)の補正に総タンパク量を使用したいためです。
Western等の他の検討には使用しません。
簡便で正確な方法だとありがたく思います。
ご教授いただけますと幸いでございます。

@RIPA buffer等で溶かす。
手間が多い。
A1N NaOHを培養細胞にかけて、30分以上OvernightOKで放置し、それをそのままBradford法等で測定する。
知人に伺ったのですが、自分で行うと値が多少ぶれやすい様で、困っています。
以上、よろしくお願いいたします。

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