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(無題) 削除/引用 No.8869-13 - 2020/05/25 (月) 02:31:47 - おお 同じ酵素で切ったベクターでいろいろなインサートを同時に入れたりすると、コロニー数はインサートによって大きく異なっていて、コロニー数だけでは簡単に判断できないこともあります。評価はインサートが入っているかでみるほうがいいのかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.8869-12 - 2020/05/24 (日) 11:17:48 - のむ みなさんコメントありがとうございます。 早速コロニーPCRを行い、今インサートの入っているクローンがあることが確認できました。ただセルフライゲーションと思われるものもあったのでNotIが働いていなさそうであることも確認できました。 次回クローニングするような時には、インサートだけでライゲーションするコントロールも保険として持っていこうと思います。 この度はありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8869-11 - 2020/05/23 (土) 18:36:41 - 数字？？？ EcoR1 Bgl2 Hind3 EcoR5 うわぁ・・・

(無題) 削除/引用 No.8869-10 - 2020/05/23 (土) 18:26:15 - AP > そもそもローマ数字をIだのVだのアルファベットで代用してるわけですし。 これは不適当でした。アルファベットそのものですから。 ちょっと機種依存文字が頭をよぎったみたい

(無題) 削除/引用 No.8869-9 - 2020/05/23 (土) 18:17:11 - AP > Not1　→　NotI >CIP →　CIAP 制限酵素の数字をアラビア数字にするのは、特にプレインテキストベースの掲示板なんかでは、よくやることです。ローマ数字だと読み紛らしいし、そもそもローマ数字をIだのVだのアルファベットで代用してるわけですし。 CIPという省略も昔からあります。口でもシップと言われること多いです。

(無題) 削除/引用 No.8869-7 - 2020/05/23 (土) 18:14:36 - AP プライマーにデザインした制限酵素サイトを切断するのは意外と効率が悪いです。 下手すると全く切れていないかも。 もちろん、Not1サイトの外側に「足場」となるヌクレオチドを十分な数、付加していると思いますが、念のため確認しておきます。 切断効率は、インサートだけでライゲーションして重合が起こっているかどうかで評価できます。100%切れていれば、元のサイズのまま残る断片はなくなるはずですが、なかなかそうはいかないものです。 経験上、PCRサイクルが多すぎると切れなくなる割合が増えるように思います。プライマーからの新規合成が減って、二重鎖PCR産物の解離、再会合が起こるようになってアニールが不完全な二重鎖が増えるのかなあと想像しています。 それと、耳にタコかもしれませんが、切り出しの時、UVのあてすぎに注意。

(無題) 削除/引用 No.8869-6 - 2020/05/23 (土) 17:22:32 - ちき > ベクターのみのネガコンと大して変わらないコロニー数でも、ほとんどが当たりってことも。まずはミニプレップしてみたらどうですか？ そう思います。 その上でうまくいっていなかった場合ですが、自分ならPCR産物の端が制限酵素で切れていない可能性をまず最初に疑います。

(無題) 削除/引用 No.8869-5 - 2020/05/23 (土) 17:09:39 - 一知半解 インサートのサイズや、インサートとベクターにモル比によっては、望むようなライゲーション産物の割合が低いこともありますよ。ベクターのみのネガコンと大して変わらないコロニー数でも、ほとんどが当たりってことも。まずはミニプレップしてみたらどうですか？

(無題) 削除/引用 No.8869-4 - 2020/05/23 (土) 12:25:02 - のむ 774R さん コメントありがとうございます。 お恥ずかしい・・訂正していただきありがとうございます。 クローニングは全くの素人なので不安が残りますが明日またアップデートさせてください＞＜;

(無題) 削除/引用 No.8869-3 - 2020/05/23 (土) 10:07:06 - 774R CIPについてはメーカーによってCIAPだったりCIPだったりするので問題ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.8869-2 - 2020/05/23 (土) 10:02:54 - 774R >考え方として間違っていないか確認させていただけると助かります。 私に分かる範囲で間違いを指摘いたします。 Not1　→　NotI CIP →　CIAP リン酸化　→　脱リン酸化

陽性コロニーが得られません＞＜ 削除/引用 No.8869-1 - 2020/05/23 (土) 08:34:23 - のむ 制限酵素の兼ね合いでNot1しか使えません。 インサートのPCRは両端にNot1サイトを設け、vector側は100 ngをNot1消化ののち、CIPでリン酸化、その後、ゲルから切り出し抽出を行いました。 対照群（ネガコン）はインサートなし。実験群ではインサートを加えて、T4 ligase, 3 hrs, R.T.でトラフォメしました。結果は対照群、実験群共にコロニー数は30個ほどでした。 理想的には対照群と実験群とは大きく数が異なると予想していました。 この解釈として、 もしNot1がへたっていたのなら、コロニー数は共に30個では少なすぎる。そのため酵素はきちんとワークしていると考えます。次にCIPがへたっていたのなら、やはりセルフライゲーション産物ができるため共に30個では少なすぎる。 最後の可能性として、ライゲーションですが、これがへたっているのがもっとも可能性としてありそうです。 今回ライゲースを新しいものに購入しましたが、うまくいくでしょうか。 考え方として間違っていないか確認させていただけると助かります。 購入したのはT4-Hi ligaseというもので、値段はT4ライゲースと変わらずでした。

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